本文发表于 Nature 杂志，2023年6月22日第618期，由来自德国法兰克福歌德大学医学院生物化学 II 研究所的 F. X. Reymond Sutandy, Ines Gößner, Georg Tascher 和通讯作者 Christian Münch 共同完成。

这项研究属于细胞生物学和分子生物学领域，聚焦于细胞应激反应机制。其核心目标是解析人类细胞中线粒体未折叠蛋白反应 的信号传导机制。背景知识指出，当线粒体内部发生蛋白质错误折叠等蛋白毒性应激时，会激活一种称为线粒体未折叠蛋白反应的核转录反应，通过上调线粒体伴侣蛋白和蛋白酶的表达来恢复线粒体蛋白质稳态。然而，对于人类细胞而言，线粒体错误折叠应激（Mitochondrial Misfolding Stress， MMS）的信息如何从线粒体传递到细胞核，从而启动UPR^mt，仍然是一个未解之谜。以往的研究表明，整合应激反应 与线粒体应激有关，但最近证据提示UPR^mt 可能是一个独立的过程。本研究旨在揭示连接线粒体应激与核转录反应的精确分子信号通路。

研究流程详述如下： 研究首先利用线粒体HSP90抑制剂Gamitrinib-TPP 诱导 MMS，作为核心模型。整个工作流程包含多个相互关联的环节，综合运用了转录组学、蛋白质组学、遗传学、细胞成像和生化分析等多种技术。

第一部分：早期反应与ISR作用评估。 研究对象为人类HeLa细胞。研究者首先通过时间分辨的定量PCR监测了GT处理后的早期基因表达变化。他们发现，UPR^mt 标志基因（如 *HSPD1*， *HSPE1*， *HSPA9*）在2-3小时内被显著诱导。同时检测了ISR 的关键效应因子ATF4及其下游靶点CHOP，发现ATF4在UPR^mt 之前被诱导，而CHOP的诱导模式与UPR^mt 基因相似。为了确定ISR 是否为UPR^mt 所必需，他们利用CRISPR-Cas9技术敲除了 ATF4 和 CHOP 基因。结果表明，即使同时敲除这两个主要ISR效应因子，UPR^mt 的诱导也未受抑制，从而排除了ISR-ATF4 轴是UPR^mt 启动的必要条件。

第二部分：鉴定活性氧在UPR^mt激活中的作用。 为了系统寻找UPR^mt 的信号分子，研究者对GT处理3小时内的细胞进行了时间分辨的转录组学分析。对489个上调基因的富集分析显示，“氧化应激反应”通路显著富集，提示活性氧可能参与信号传导。他们使用MitoSOX探针进行流式细胞术检测，证实MMS 确实导致线粒体活性氧水平升高。为了验证mtROS 的必要性，他们在GT处理的同时使用了多种抗氧化剂（如NAC， GSH， MnTBAP），结果所有这些抗氧化剂都完全抑制了UPR^mt 基因的诱导，但不影响线粒体蛋白聚集物的形成。相反，使用复合体III抑制剂Antimycin A 增加mtROS，则能增强UPR^mt 的激活。然而，单独使用Antimycin A 或复合体I抑制剂Rotenone 增加mtROS，并不能有效激活UPR^mt，表明仅有mtROS 信号是不够的，且mtROS 的产生位点具有特异性。为了追踪ROS 的亚细胞定位，他们使用了靶向线粒体不同区室（膜间隙、基质）以及细胞质/细胞核的超敏感H2O2探针HyPer7。活细胞成像显示，GT处理后1小时内，线粒体膜间隙和基质的H2O2水平显著上升，随后细胞质中的H2O2水平也升高。使用线粒体外膜孔道VDAC1 的抑制剂DIDS阻断ROS 从线粒体向细胞质的运输，则废除了UPR^mt 的激活。这些结果共同证明，mtROS 的产生并扩散至细胞质是UPR^mt 信号传导的关键一环。

第三部分：鉴定细胞质靶点Dnaja1及其氧化修饰。 既然mtROS 需要扩散到细胞质起作用，研究者推测其可能氧化某个细胞质蛋白。为此，他们进行了非偏向性的、多重标记的氧化还原蛋白质组学分析。他们在GT处理3小时内，鉴定细胞质中可逆性半胱氨酸氧化发生变化的蛋白质。分析发现，细胞质HSP40 家族蛋白Dnaja1 的第149和150位半胱氨酸在GT处理后氧化水平增加。这两个半胱氨酸位于Dnaja1 的锌指样结构域，该结构域的氧化已知会影响其活性。基因敲低实验显示，敲低Dnaja1（而非其他HSP40成员）能阻止UPR^mt 的激活，证明Dnaja1 是UPR^mt 信号传导的必需组分。

第四部分：阐明Dnaja1的功能机制。 为了理解Dnaja1 的作用，研究者进行了定量相互作用蛋白质组学分析。他们发现，在GT处理期间，Dnaja1 与大量线粒体蛋白以及细胞质HSP70 的结合显著增加。这种Dnaja1-HSP70 相互作用的增强是ROS 依赖性的。通过构建Dnaja1 C149V/C150V 突变体来模拟氧化状态（移除与锌离子结合所需的半胱氨酸），他们发现该突变体能增强Dnaja1 与HSP70 的结合，与GT处理的效果一致。这些数据表明，MMS 诱导的mtROS 氧化了Dnaja1 的锌指样结构域，从而增强了其招募HSP70 的能力。细胞定位实验排除了Dnaja1 在应激期间错误定位于线粒体的可能性，确认这些相互作用发生在细胞质。同时，细胞凋亡检测表明，与Dnaja1 相互作用的线粒体蛋白在细胞质中的出现并非由凋亡引起。

第五部分：发现第二个关键信号——细胞质中积累的线粒体蛋白前体。 研究者进一步探究了为何Dnaja1 会结合更多线粒体蛋白。他们注意到，绝大多数线粒体蛋白是在细胞质中合成为前体蛋白，然后输入线粒体并被加工成熟。在酵母中，线粒体蛋白前体在应激时会在细胞质积累并激活应激反应。他们推测人类细胞中可能存在类似机制。Western Blot实验证实，GT处理导致了线粒体蛋白前体形式的积累。使用MTS-EGFP报告系统或HaloTag标记新合成蛋白的活细胞成像实验均显示，GT处理引起了线粒体蛋白输入缺陷，导致报告蛋白在细胞质和细胞核中积累，这种积累是ROS 非依赖性的。当用环己酰亚胺抑制细胞质蛋白质翻译以减少新生成的前体蛋白，或者敲低线粒体生物发生因子NRF1 以减少线粒体蛋白的转录时，UPR^mt 的激活被削弱。这些结果表明，细胞质中线粒体蛋白前体的积累（Cytosolic Mitochondrial Protein Precursor Accumulation， c-mtProt）构成了激活UPR^mt 的第二个独立且必需的信号。

第六部分：整合信号并鉴定下游转录因子HSF1。 接下来需要找到整合mtROS 和c-mtProt 信号并传导至细胞核的因子。由于在酵母中c-mtProt 已知能通过调节热休克因子1 来重塑转录，研究者检查了HSF1 的作用。敲低HSF1 完全废除了UPR^mt 的诱导，且HSF1 敲除细胞的基线线粒体伴侣蛋白水平也降低，表明HSF1 是线粒体伴侣蛋白转录的组成型关键调节因子。免疫荧光和细胞组分分离实验显示，GT处理促使HSF1 从细胞质向细胞核转位。这种激活依赖于mtROS（可被抗氧化剂抑制）和c-mtProt（可被CHX或NRF1敲低抑制）。重要的是，敲低Dnaja1 也显著抑制了HSF1 的核转位。已知在稳态下，HSP70 与HSF1 结合并抑制其转录活性。免疫共沉淀实验表明，GT处理后HSF1-HSP70 的相互作用减少。这支持了一个模型：c-mtProt 通过氧化的Dnaja1 大量招募细胞质HSP70，从而将HSP70 从HSF1 上“滴定”走，释放并激活HSF1，使其进入细胞核启动UPR^mt 基因的转录。

第七部分：验证通路普遍性及生理相关性。 为了确认该通路的普遍性，研究者使用其他诱导线粒体蛋白错误折叠的应激源（如Lon蛋白酶抑制剂CDDO、HtrA2抑制剂UCF-101）进行处理，发现UPR^mt 的激活同样依赖于ROS 和c-mtProt，并由Dnaja1 和HSF1 介导。他们还通过遗传学方法诱导UPR^mt>，如在 线粒体中过表达易于聚集的Aβ蛋白，或双重敲低线粒体蛋白酶LONP1和PITRM1，其UPR^mt 激活也依赖于Dnaja1 和HSF1。这证实了ROS + c-mtProt → Dnaja1 → HSF1 轴是不同线粒体应激源激活UPR^mt 的共同通路。生理功能上，敲除HSF1 的细胞在MMS 下表现出更严重的线粒体蛋白输入缺陷和更低的细胞存活率，突出了该通路在维持细胞存活中的重要性。最后，他们尝试在不直接引起MMS 的情况下激活该通路。单独使用Antimycin A（增加mtROS）或Oligomycin A（抑制ATP合酶，已知会引起c-mtProt 积累）均不能有效激活UPR^mt。然而，将两者联用，则可以同时诱导mtROS 和c-mtProt，并成功激活UPR^mt。这进一步证实了mtROS 和c-mtProt 是启动该信号通路的两个必要且充分的条件。

本研究的主要结论是： 在人类细胞中，线粒体未折叠蛋白反应的激活由一种高度调控的细胞质监视机制介导。该机制整合了两个独立的线粒体应激信号：1）释放到细胞质中的线粒体活性氧（mtROS）；2）因线粒体蛋白输入缺陷而在细胞质中积累的线粒体蛋白前体（c-mtProt）。mtROS 氧化细胞质HSP40蛋白Dnaja1，增强其结合HSP70 的能力。c-mtProt 则作为Dnaja1 的客户蛋白，通过氧化的Dnaja1 大量招募HSP70，从而将HSP70 从转录因子HSF1 上解离出来。释放的HSF1 随后转位至细胞核，激活包括线粒体伴侣蛋白和蛋白酶在内的UPR^mt 基因的转录。

这项研究的科学价值与应用意义重大： 首先，它首次清晰地描绘了人类细胞中UPR^mt 从线粒体到细胞核的完整信号传导通路，解决了该领域长期存在的核心问题。其次，它揭示了线粒体蛋白质稳态与细胞质蛋白质稳态网络之间前所未有的直接联系，为理解细胞在应对细胞器应激时的全局协调机制提供了全新视角。第三，该研究提出了一个“双信号闸门”模型，即需要同时满足mtROS 和c-mtProt 两个条件才能有效激活UPR^mt，这解释了为何某些仅产生单一信号的线粒体扰动（如单纯电子传递链抑制）不能引发完整的UPR^mt。最后，这一通路为理解与线粒体功能障碍和蛋白质稳态崩溃相关的疾病（如神经退行性疾病、衰老等）提供了潜在的分子机制，Dnaja1、HSF1 等关键节点可能成为未来干预治疗的靶点。

本研究的亮点在于： 1）重要的原创性发现：首次鉴定出mtROS 和c-mtProt 作为激活人类UPR^mt 的双信号，并阐明了其通过Dnaja1 氧化和HSF1 激活进行整合的精密机制。2）系统性与多学科方法：研究设计精巧，逻辑严谨，从全基因组转录组筛选出发，结合氧化还原蛋白质组学、相互作用蛋白质组学、高分辨率活细胞成像、遗传操控（敲低/敲除、点突变）和生化分析，形成了完整的证据链。3）机制的普遍性与生理相关性验证：不仅在一个药理模型（GT）中阐明机制，还通过多种其他化学和遗传学应激源验证了该通路的普遍性，并证明了其在维持细胞存活中的关键作用。4）澄清了领域内的争议：明确将UPR^mt 与ISR 区分开来，并阐明了之前研究中涉及的转录因子ATF5可能主要作用于UPR^mt 激活之后，而非启动阶段。