本报告介绍一篇于2016年7月5日发表在《Annual Review of Biophysics》期刊上的学术综述论文，标题为《蛋白折叠的机制与原理：通过氢交换、片段分离与质谱技术》，作者是来自宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院Johnson研究基金会的S. Walter Englander、Leland Mayne、Zhong-Yuan Kan和Wenbing Hu。该文是一篇关于蛋白质折叠研究领域的深度综述，系统阐述了氢交换（Hydrogen Exchange， HX）技术的发展，特别是结合质谱（Mass Spectrometry， MS）的HX-MS脉冲标记技术，如何推动了人们对蛋白质折叠路径和中间体结构的理解，并提出了与传统的漏斗状能量景观理论不同的“确定的折叠路径”模型。论文的核心在于论证许多蛋白质通过一系列结构明确、类似天然态的中间体，按照可重复的顺序进行逐步折叠，这一过程由蛋白质固有的、协同的折叠单元（foldon）及其“顺序稳定化”原理所驱动。
主要观点阐述
观点一：蛋白质折叠研究长期面临困境，传统理论与技术存在局限性。 论文开篇即指出，尽管蛋白质折叠问题处于生物物理学的核心，且距Anfinsen证明蛋白质可自发折叠已过去55年，但尚未出现一个被广泛接受的折叠模型。传统上，实验科学家因难以捕捉和研究瞬态折叠中间体，转而研究可能的影响因素（如未折叠态结构、天然态拓扑等），但这些研究由于对折叠过程本身缺乏了解而存在问题。理论方面，为解释Levinthal悖论（蛋白质无法通过随机搜索在合理时间内找到天然态），发展出了“漏斗状能量景观”理论，该理论认为蛋白质通过大量平行路径，在能量下坡驱动下收敛至天然态。然而，作者指出，这一理论在foldon单元被发现之前提出，且其灵活性使其可以适配包括确定路径模型在内的多种场景，因此缺乏特异性。这为引入新的实验证据和模型提供了必要性。
观点二：氢交换（HX）技术，特别是HX-MS脉冲标记与片段分离技术，是解析折叠中间体结构的关键突破性工具。 为了直接观察折叠过程中的结构变化，论文重点介绍了氢交换（HX）技术的原理与发展。蛋白质主链酰胺氢原子可与溶剂水中的氢发生交换，其交换速率对蛋白质的局部和长程结构、动力学及能量学极其敏感。作者详细回顾了HX技术的演进历程：从Linderstrøm-Lang开创性的整体HX测量，到Englander等人发展的片段分离技术（利用低pH下交换速率最慢的特点，将蛋白酶解成肽段后分析），再到结合电喷雾电离质谱（ESI-MS）形成强大的HX-MS技术。尤其关键的是“脉冲标记”（Pulse Labeling）方法：先将蛋白在D₂O中展开并氘代，然后快速稀释到H₂O折叠缓冲液中启动折叠；在不同折叠时间点，施加一个短暂的高pH脉冲，使此时尚未被结构保护的酰胺位点发生H-D交换而被标记；随后立即淬灭至低pH，通过在线蛋白酶解、高效液相色谱（HPLC）分离和质谱分析，可以精确测量数百个重叠肽段上氘标记的保留情况。这项技术的发展，特别是近年来在减少背交换、提高肽段覆盖率和数据分析（如EXMS、HDSite程序）方面的进步，使得实时、近氨基酸分辨率地监测折叠动力学成为可能。
观点三：蛋白质由协同的“折叠单元”（foldons）构成，这些单元在平衡态下表现为分级的亚全局去折叠反应。 在阐述折叠动力学研究之前，论文首先建立了一个重要的结构基础概念——折叠单元（foldons）。这一发现源于“天然态氢交换”实验（图3）。当在低于蛋白变性点的低浓度变性剂条件下测量HX时，发现不同残基的HX速率对变性剂的敏感性不同。这揭示了一系列能量分级的、协同的亚全局去折叠反应，每个反应会暴露一组特定的酰胺氢。通过定点突变稳定性标记实验，可以确定这些协同去折叠单元的具体构成。以细胞色素c（cyt c）为例，其天然态可分解为五个独立的foldon单元（如图1所示，以不同颜色标示），每个单元由在空间上相邻但在序列上可能不连续的二级结构元素组成。这些foldon在平衡态下形成一个能量阶梯，从仅有一个foldon去折叠的部分去折叠形式（Partially Unfolded Forms， PUFs）逐步到完全去折叠态。这一发现意味着蛋白质的构建模块不是单个氨基酸，而是这些协同的、类似天然结构的foldon。
观点四：HX-MS脉冲标记实验直接观测到，多种蛋白质通过确定的、逐步的、全群一致的折叠路径进行折叠，中间体具有天然态结构特征。 这是论文的核心实证部分。作者展示了将HX-MS脉冲标记技术应用于多种蛋白质（如脱辅基黄素氧还蛋白、核糖核酸酶H、麦芽糖结合蛋白、细胞色素c、细胞视黄酸结合蛋白变体P85A）所获得的数据（图4，图5）。从原始质谱数据（图4c）可以直观看出关键信息：对于任一给定肽段，其氘标记模式在折叠过程中呈现双峰分布，直接从“未保护”（轻质量）跳变到“已保护”（重质量），这表明该肽段所代表的区域是协同地、一步到位地形成保护，而非逐个残基缓慢获得保护。不同肽段（即不同蛋白区域）获得保护的动力学时间点不同，且整个蛋白质分子群（>95%）同步经历每一步折叠。此外，在折叠步骤中达到保护程度的位点数量，与完全折叠的天然蛋白中能抵抗脉冲标记的位点数量基本一致，证明每一步形成的中间体在局部具有天然态结构。这些观察结果共同指向一个清晰的图景：蛋白质折叠遵循一个确定的（defined）、逐步的（stepwise）、全群一致的（population-wide）路径，不同foldon单元按照特定的时间顺序依次组装。
观点五：蛋白质折叠的确定路径由“顺序稳定化”原理驱动，并受到foldon单元构建方式的约束，这与基于大量平行路径的漏斗能量景观范式不同。 在实验观测的基础上，论文提出了驱动这一确定路径的原理。折叠的第一步（通常是某个foldon）需要通过无引导的随机构象搜索来形成，这可能是一个能量上坡的过程，但由于foldon单元本身尺寸有限，此搜索是可行的。一旦初始的天然态结构形成，随后的折叠步骤则受“顺序稳定化”（sequential stabilization）原理指导：已形成的天然态结构通过提供互补的相互作用表面，引导并稳定相邻的下一个foldon单元的折叠，类似于“结合诱导折叠”的行为。因此，折叠路径的顺序是由蛋白质的foldon组织架构以及它们之间的天然相互作用所预先决定的（hard-wired）。作者明确将这一“确定的路径”观点（图1）与经典的“漏斗状能量景观”理论进行了对比。后者假设折叠单元是更小的、非协同的单位，从而导致大量独立的平行路径。而本文基于HX-MS的实验证据表明，对于所研究的蛋白质，主要的折叠通量（folding flux）是通过一条占主导地位的、结构明确的路径进行的，能量景观更接近于一个具有明确中间态能垒的阶梯状路径，而非光滑的漏斗。
观点六：观察到的折叠动力学分离可能由条件依赖的能垒决定，而非中间体形成本身，这解释了传统光谱学方法解释折叠动力学的困难。 论文还深入分析了折叠动力学的细节。不同foldon形成步骤之间的时间间隔（动力学分离）表现出高度特异性和不可预测性。例如，在细胞色素c中，蓝色foldon的形成因组氨酸与血红素的误配位而受到阻碍；后续步骤则受脯氨酸异构化部分错误的影响。此外，在脉冲标记过程中，已形成的结构可能发生部分瞬时去折叠（back unfolding），导致测量到的保护幅度低于100%。这些因素表明，观察到的动力学复杂性往往源于折叠过程中遭遇的特定能垒（如误配位、脯氨酸异构化），而非foldon组装步骤本身固有的速率差异。这很好地解释了为何仅依赖整体信号（如荧光）的动力学研究难以解析中间体，并常常被误解为“两态折叠”，因为快速的中间步骤可能因能垒小而无法与前后步骤区分开来。
论文的意义与价值 这篇综述具有重要的科学价值。首先，它系统总结了HX-MS这一强大技术平台的发展脉络和应用逻辑，为领域内外的研究者提供了清晰的技术路线图。其次，它基于坚实的实验数据，提出了一个与主流理论不同的、关于蛋白质折叠机制的具体模型——“确定的折叠路径”模型，并提供了以foldon和顺序稳定化为核心的物理解释框架。这挑战了纯粹基于能量景观理论的、认为折叠路径高度简并的观点，推动了关于蛋白质折叠物理原理的深入讨论。第三，论文指出了未来研究方向：需要在更广泛的蛋白质类型、大小和拓扑结构中检验该模型的普适性；深入理解foldon的形成原理；阐明分离折叠步骤的具体动力学事件；以及如何将海量的前期实验和理论研究与本文的结论相调和。因此，这篇综述不仅是对过去研究成果的总结，更是为未来蛋白质折叠研究设定了一个新的议程和挑战。