本研究由清华大学合成与系统生物学中心的Kang Ren、Yiqing Zhao、Guo-Qiang Chen、Xiang Ao和Qiong Wu共同完成，并于2024年发表在期刊ACS Synthetic Biology上，题为《基于Halomonas bluephagenesis内源性hbpb/hbpc毒素-抗毒素系统的稳定表达系统构建》。

学术背景
Halomonas bluephagenesis是一种嗜盐细菌，能够通过高盐度开放发酵高效生产聚羟基脂肪酸酯（PHA）和其他高价值化学品，是下一代工业生物技术（Next-Generation Industrial Biotechnology, NGI）的重要平台。然而，目前对该菌的基因改造主要依赖基因组编辑技术，过程复杂且耗时；而基于质粒的表达系统则需要抗生素维持，增加了大规模发酵的成本和环境污染风险。毒素-抗毒素（Toxin-Antitoxin, TA）系统为质粒稳定维持提供了解决方案，但嗜盐菌中有效的TA系统尚未充分开发。本研究旨在基于H. bluephagenesis内源性质粒phbcp中的新型TA系统hbpb/hbpc，构建一种无需抗生素的稳定重组质粒载体，以解决上述问题。

研究流程
1. 内源性质粒phbcp的鉴定与稳定性验证
- 通过第三代全基因组测序发现H. bluephagenesis TD01携带一个6,009 bp的环状质粒phbcp，包含10个开放阅读框（ORFs）。
- 通过琼脂糖凝胶电泳和PCR验证phbcp的存在（图1b-c）。
- 在三种不同培养条件下（冷冻保存、基因组编辑后、高密度发酵后）验证phbcp的稳定性，结果显示其均能稳定存在（图1d）。

1. hbpb/hbpc TA系统的功能验证

   • 过表达phbcp中的9个ORFs，发现orf f3（后命名为hbpc）导致细胞死亡，而orf f2（hbpb）可中和其毒性（图S1）。
     
   • RT-PCR证实hbpb和hbpc位于同一操纵子（图2a）。
     
   • 共表达实验显示，hbpb能完全抑制hbpc的毒性（图2b），符合典型TA系统的特征。
     

2. 重组质粒phbpbc的构建

   • 利用CRISPR/Cas9技术敲除内源性phbcp，获得质粒游离菌株H. bluephagenesis LCP（图3a）。
     
   • 设计重组质粒phbpbc，包含phbcp复制原点、repb基因、hbpb/hbpc操纵子及筛选标记（图3b）。
     

3. 质粒稳定性与表达效率评估

   • 将sfgfp（绿色荧光蛋白基因）通过三种策略导入H. bluephagenesis：基因组整合、常规质粒pseva341和phbpbc。
     
   • 连续传代7天后，phbpbc在无抗生素条件下质粒保留率接近基因组整合（>95%），显著高于pseva341（25.6%）（图4）。
     
   • phbpbc的sfgfp表达水平是基因组整合的2.5-4倍，且高于pseva341（图5）。
     

主要结果与逻辑关系
- phbcp的稳定性提示其可能携带TA系统，后续实验验证了hbpb/hbpc的功能。
- 通过消除内源性质粒并构建phbpbc，实现了无需抗生素的质粒稳定维持。
- 表达效率对比证明phbpbc兼具高稳定性和高表达水平，优于传统策略。

结论与价值
本研究首次在H. bluephagenesis中开发了基于内源性TA系统的稳定表达载体phbpbc，其特点包括：
1. 科学价值：揭示了hbpb/hbpc的新型TA机制，为嗜盐菌基因工具开发提供新思路。
2. 应用价值：解决了抗生素依赖问题，降低了NGI技术的成本和环境风险，适用于大规模工业发酵。

研究亮点
1. 创新性方法：首次将CRISPR/Cas9用于嗜盐菌内源性质粒敲除，并自主设计phbpbc载体。
2. 高效表达：phbpbc的蛋白表达水平显著高于基因组整合，突破了传统质粒的局限性。
3. 跨平台潜力：该策略可推广至其他非模式嗜盐菌的遗传改造。

其他有价值内容
转录组分析表明hbpb/hbpc可能影响宿主苯丙氨酸代谢（图S3），为后续TA系统调控机制研究提供了方向。此外，研究团队已就相关技术申请专利，体现了其产业化潜力。