学术研究报告：蛋白质穿过纳米孔单列传输过程中球状结构的形成
一、研究概况
本研究由荷兰格罗宁根大学（University of Groningen）格罗宁根生物分子科学与生物技术研究所化学生物学部的Adina Sauciuc、Jacob Whittaker、Matthijs Tadema、Katarzyna Tycha、Albert Guskov以及Giovanni Maglia共同完成。通讯作者为Giovanni Maglia。该研究成果于2024年9月12日发表于《美国国家科学院院刊》（PNAS），论文标题为《Blobs form during the single-file transport of proteins across nanopores》。该研究论文为开放获取文章，遵循CC BY-NC-ND 4.0许可协议。
二、研究背景与科学问题
生物聚合物穿过纳米孔的传输是当前生物物理学和生物技术领域的重要研究方向。该过程不仅在生物体内具有重要的生理意义，而且在单分子分析技术的开发中展现出巨大潜力。目前，DNA等均匀带电聚合物的电泳驱动传输机制已经获得了较为深入的理解。在α-溶血素（αHL）、耻垢分枝杆菌孔蛋白A（MspA）和脆弱拟杆菌毒素C（FraC）等多种纳米孔中，单链DNA的电泳驱动传输始终以单列（single-file）方式进行，从未观察到球状结构（blob）的形成。
然而，蛋白质的纳米孔传输则面临截然不同的挑战。蛋白质天然具有折叠结构，其表面电荷分布不均匀，无法像DNA一样通过强电场实现单列传输。近年来，研究人员发现在尿素等变性剂存在下，通过在纳米孔β-桶状结构域引入酸性氨基酸残基以诱导强烈的电渗流（Electroosmotic Flow，EOF），可以驱动非结构化多肽的跨膜传输。当纳米孔的阳离子选择性达到P(K⁺)/P(Cl⁻)比值大于约3.5时，电渗流足以克服电泳力（Electrophoretic Force，EPF），推动蛋白质穿过纳米孔。
本研究的核心科学问题是：在电渗流驱动的蛋白质传输过程中，何种纳米孔特性能够实现单列传输？这一问题的解答对于蛋白质测序等应用至关重要，因为只有单列传输才能实现单个氨基酸残基的逐一识别。
三、研究方法与实验流程
本研究设计了一套系统的对比实验方案，包含以下主要步骤：
1. 纳米孔的选取与改造。 研究团队选取了四种几何形状和表面化学性质各异的纳米孔进行对比实验：CytK-4D（在β-桶状区域引入四个天冬氨酸残基，cis端入口1.1纳米，最窄处1.1纳米）、野生型MspA（cis端入口约4纳米，收缩区1.0纳米）、野生型Lysenin（圆柱形，上部两个1.5纳米收缩区，下部约2纳米宽）以及工程化Aerolysin。针对Aerolysin，研究者对野生型进行了广泛的工程改造：将R220、K242和R282替换为天冬酰胺，将K238替换为天冬氨酸，构建了具有高阳离子选择性的Aer-1D-3N突变体（P(K⁺)/P(Cl⁻)为3.95±0.08）。
2. 蛋白质底物的制备。 研究使用的主要蛋白质底物为Male219a，这是麦芽糖结合蛋白的变体，携带G220D和E221P去稳定突变。该蛋白在2M尿素、1M KCl、15mM HEPES缓冲液（pH 7.5）条件下主要呈去折叠状态。Male219a包含412个氨基酸残基，根据先前研究数据插值估算，其去折叠状态的迴转半径（Radius of Gyration，Rg）约为7纳米。此外，研究者还使用了名为Tzatziki的模型底物，该底物几乎不含芳香族氨基酸残基，富含丝氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等促进无序结构的残基以及带电荷残基。
3. 电生理记录。 所有测量均在平面脂双层系统中进行，使用Axon Digidata 1550B数字转换器和Axopatch 200B放大器，通过Clampex 11.1软件记录数据。施加负电位诱导蛋白质从cis侧向trans侧传输，采样频率为50 kHz，滤波频率为10 kHz。
4. 离子选择性测定。 通过不对称盐浓度条件（cis侧2M KCl，trans侧0.5M KCl）测定反转电位，利用Goldman-Hodgkin-Katz方程计算P(K⁺)/P(Cl⁻)比值。每个纳米孔的离子选择性均通过三次独立实验确定。
5. 结构解析与分子建模。 研究团队解析了CytK-K128D-T147D-K155D突变体的晶体结构，分辨率达4.4 Å（PDB ID: 8RJ8）。该结构确认为七聚体，与α-溶血素高度相似，但cis端入口更窄（1.1纳米相较于αHL的2.3纳米）。此外，使用HOLE2程序计算各纳米孔的内径剖面，并通过Modeller软件进行同源建模。
6. 定点突变与纳米孔改造。 为探究纳米孔入口尺寸、前庭区域和表面化学性质对传输行为的影响，研究者进行了系统的突变分析。在CytK-4D基础上进行N端逐步截短（ΔN2、ΔN4、ΔN6和ΔN8），并在前庭区域和β-桶状区域引入特定氨基酸替换。
四、主要实验结果
1. 四种纳米孔的传输行为差异显著。
在CytK-4D纳米孔中，-60至-120 mV范围内，Male219a诱导出清晰的电流阻塞事件，平均排阻电流（Iex%）为71.9±0.8%（-80 mV），事件驻留时间随电压升高而急剧下降（从24.4±6.7 ms降至3.3±0.5 ms），证明蛋白质成功穿过纳米孔。
MspA野生型纳米孔在相同条件下出现两类事件。I型事件表现为多层次电流信号，驻留时间在-60至-120 mV范围内递减（11.5±0.9 ms至5.8±0.3 ms），但在高于-120 mV时反而增加至7.3±0.6 ms，且Iex%持续升高至87.2±1.7%，表明蛋白质在高压下阻塞在收缩区。II型事件较短，驻留时间随电压升高而增加，推测为蛋白质捕获后释放回cis侧。
Lysenin野生型纳米孔在整个测试电压范围内均表现出多层次电流事件，驻留时间持续下降，表明蛋白质穿过纳米孔。但在-100 mV处存在转折点，前后两个区间的传输行为呈现不同趋势。
Aerolysin 1D-3N和2D-3N纳米孔在标准条件下几乎只产生长时程完全阻塞事件。仅当KCl浓度提高至1.8 M时才能观察到传输事件，但驻留时间仍极长（-80 mV时为622±25.5 ms）。研究者将此归因于Aerolysin约14纳米宽帽状结构域与去折叠多肽之间的静电相互作用。
2. 球状结构形成机制。
研究团队基于实验结果提出了球状结构形成的物理机制。当纳米孔直径远小于聚合物持久长度（Persistent Length，Lp）时，聚合物遵循Odijk机制，呈拉伸构象；当直径远大于Lp时，进入de Gennes机制，形成球状结构。多肽的Lp在溶液中的报道值介于单个氨基酸残基（约0.34纳米）至五个残基（约1.8纳米）之间。
在MspA中，约4纳米的cis端入口远大于多肽Lp，蛋白质以部分卷曲状态进入纳米孔腔体。电渗流和电泳力可进一步压缩卷曲结构，在腔体内形成球状结构。当球状结构到达1.0纳米收缩区时，或者解卷，或者以不同尺寸的球状形式穿过，形成多层次电流信号。在高于-120 mV时，球状结构被压缩在收缩区，降低离子电流，削弱电渗流，阻碍传输。
3. 纳米孔几何形状的关键作用。
N端截短实验的结果充分验证了上述机制。ΔN2、ΔN4和ΔN6截短对传输行为影响不大，但ΔN8截短将cis端收缩区直径扩大至约2.7纳米后，立即引发了长时程多层次电流事件，验证了扩大入口直径促进球状结构形成的假说。
4. 表面化学性质的调控作用。
在前庭区域靠近β-桶状入口处引入芳香族残基（A109W、T157F/W）或亲水性替换（V110T），均导致事件驻留时间显著延长。在β-桶状区域内引入S126F突变后，传输速度降低约10倍，Iex%从71.3±0.8%增至89.2±0.6%（-100 mV），并出现了类似MspA和Lysenin的多层次电流特征。
关键的验证性实验使用了不含芳香族残基的Tzatziki底物。该底物在CytK-4D中表现出平滑的传输特征，Iex%约90%。更重要的是，即使存在S126F突变，Tzatziki的电流特征也未发生显著改变，Iex%仅变化2-3%，速度变化也仅约2倍。这直接证明了多肽-纳米孔间的芳香族/疏水相互作用是球状结构形成的重要促进因素。
五、研究结论与意义
本研究得出的核心结论是：电渗流驱动下的蛋白质纳米孔传输过程中，球状结构的形成是普遍现象，这与电泳驱动下DNA的普遍单列传输形成鲜明对比。实现蛋白质单列传输需要同时满足三个条件：第一，纳米孔的入口和内部直径均小于聚合物的持久长度（<约1.2纳米）；第二，纳米孔内表面不含有与多肽疏水残基相互作用的芳香族残基（即非粘性表面）；第三，保持适中的传输速度。
该研究的科学价值在于首次系统揭示了纳米孔几何形状、表面化学性质与蛋白质传输行为之间的构效关系，为理解限域效应下的聚合物物理行为提供了新的实验证据。从应用价值看，这些发现为蛋白质测序纳米孔的设计与工程化提供了明确的设计原则，推进了单分子蛋白质分析技术的发展。
六、研究亮点
本研究的主要亮点包括：1）首次在多纳米孔系统中比较了蛋白质与DNA传输行为的根本差异；2）提出了电渗流驱动下蛋白质球状结构形成的物理机制，并通过系统的纳米孔突变实验加以验证；3）利用不含芳香族残基的模型底物Tzatziki巧妙地证明了疏水相互作用在球状结构形成中的关键作用；4）解析了CytK突变体的高分辨率晶体结构，为后续工程改造提供了结构基础；5）建立了实现蛋白质单列传输的三条明确设计原则，具有直接的实践指导意义。