近日，国际知名期刊《Journal of Cell Biology》发表了一项由中国科研团队完成的原创性研究成果，题为“Axin的相分离组织β-catenin破坏复合体”。这项研究由Junxiu Nong、Kexin Kang、Qiaoni Shi（共同第一作者）及Ye-Guang Chen（共同通讯作者）等人共同完成，作者单位包括清华大学膜生物学国家重点实验室、生命科学学院、教育部蛋白质科学重点实验室以及广州再生医学与健康广东省实验室等。研究发表于2021年。
该研究的科学领域聚焦于细胞信号转导，特别是经典的Wnt/β-catenin信号通路。在这一通路中，核心转录共激活因子β-catenin的蛋白水平受到“β-catenin破坏复合体”的精密调控。该复合体由支架蛋白Axin、腺瘤性结肠息肉病蛋白APC、糖原合成酶激酶3βGSK3β、酪蛋白激酶1αCK1α等组成。在无Wnt信号时，破坏复合体通过磷酸化标记β-catenin，促使其被泛素-蛋白酶体系统降解，从而维持细胞质内β-catenin的低水平。然而，尽管该复合体各组分已研究多年，但其在细胞内是如何高效、动态地组装并执行功能，其背后的物理化学机制一直不甚明了。近年来，生物大分子液-液相分离作为一种在细胞内形成无膜细胞器（或称生物分子凝聚物）的重要机制被广泛关注，它能够通过多价相互作用将特定分子富集在空间受限的区室内，显著促进生化反应的效率。研究团队注意到，Axin和APC均具备多价性、含固有无序区域IDR、在细胞内可形成点状结构等相分离蛋白的典型特征，因此他们提出科学假说：Axin是否通过相分离来驱动破坏复合体的组装？ 本研究的核心目标即是通过严谨的实验，验证这一假说，揭示相分离在Wnt信号通路调控中的关键作用。
研究的具体工作流程可以划分为四个主要阶段，环环相扣，层层深入。
第一阶段：验证Axin1在体内外发生液-液相分离 研究首先聚焦于Axin1。在细胞水平，研究团队利用CRISPR/Cas9技术构建了Axin1基因敲除的HEK293T细胞系。通过荧光显微镜观察发现，当以接近内源水平的剂量重新表达EGFP标记的Axin1时，该蛋白在细胞质中形成动态的、球状的点状结构。对这些点状结构进行荧光漂白恢复实验分析，发现其荧光信号能在60秒内恢复约60%。此外，两个相邻的Axin1点状结构能够相遇并融合成一个更大的球体。这些特性（球形、动态、可融合）强烈暗示了这些点状结构具有液体样性质。为了直接证明这是相分离过程，研究进一步在体外使用纯化的麦芽糖结合蛋白标签的Axin1蛋白进行实验。在添加大分子拥挤剂PEG 8000后，Axin1蛋白在数秒内便形成了微米级的球形液滴。这些液滴的尺寸随蛋白浓度升高而增大，且对盐浓度敏感。同样地，体外形成的Axin1液滴也表现出快速的FRAP恢复（3分钟内恢复30%）以及液滴融合现象。更重要的是，即使在去除MBP标签且不添加PEG的生理盐浓度条件下，足够浓度的Axin1仍能形成液滴，这证实了Axin1本身具备相分离的内在能力。这些结果汇集在一起，提供了强有力的证据，证明Axin1无论在细胞内还是体外，都能发生液-液相分离。
第二阶段：鉴定驱动Axin1相分离的关键结构域 接下来，研究需要确定Axin1蛋白中负责驱动相分离的区域。通过对一系列截短突变体在细胞和体外的系统性分析，研究团队发现了一个关键区域：固有无序区域1，简称IDR1（氨基酸209-464）。在细胞中，任何缺失IDR1的突变体（如AD1， AD3， AD5）都无法形成点状结构；而在体外，这些缺失IDR1的突变体形成液滴的能力也严重受损（液滴数量少、尺寸小）。反之，保留IDR1的突变体则保留了形成点状/液滴的能力。进一步的精细突变分析揭示，IDR1中的第281-306氨基酸区域，尤其是其中的五个带正电荷的精氨酸残基，对于相分离至关重要。更有说服力的是，当用其他已知能驱动相分离的低复杂度结构域（如来自hnRNPA1或TDP-43的特定区域）替换掉Axin1的IDR1部分时，该嵌合蛋白又能恢复在细胞中形成点状结构的能力。这些实验清晰地表明，IDR1是驱动Axin1相分离的核心元件。
第三阶段：探究APC对Axin相分离的影响及破坏复合体的组装 Axin并非独立工作，其核心搭档APC的作用至关重要。研究选用功能保守且易于操作的果蝇APC2作为研究对象。结果显示，dAPC2蛋白自身在体外也能发生相分离。当dAPC2与Axin1混合时，两者共定位在同一个液滴中，并且形成的液滴尺寸比单独Axin1或dAPC2形成的都要大。更重要的是，dAPC2的加入显著提升了Axin1液滴内部的流动性（FRAP恢复更快）。在细胞中，表达dAPC2也能提升Axin1点状结构的动态性。这些数据表明，APC不仅自身能相分离，还能促进Axin相分离液滴的增大并增强其动态性，从而优化了相分离凝聚物的物理性质。
那么，由Axin相分离形成的液滴，是否真的能作为“组装平台”来招募破坏复合体的其他成员呢？体外实验给出了肯定的答案。当将纯化的、荧光标记的GSK3β、CK1α或β-catenin蛋白与Axin1混合并诱导相分离时，所有这些蛋白都被有效地招募到Axin1液滴内部。这意味着，相分离的Axin凝聚物确实可以作为支架，将磷酸化β-catenin所需的关键酶（GSK3β， CK1α）及其底物（β-catenin）共定位在一个空间高度浓缩的微环境中。
第四阶段：验证相分离在促进β-catenin磷酸化及调控Wnt信号中的功能 研究的最终目标是确认相分离的生物学功能。为此，研究团队进行了体外磷酸化实验。结果发现，低浓度的GSK3β单独磷酸化β-catenin的效率很低。当加入CK1α（负责启动磷酸化，即磷酸化S45位点）后，GSK3β对β-catenin的磷酸化（S33/S37/T41位点）显著增强。而如果同时存在Axin1，这种磷酸化效率会得到进一步提升。最关键的是，当反应体系中加入PEG来促进相分离时，GSK3β介导的β-catenin磷酸化被极大地促进。这一效果依赖于Axin1的IDR1，因为缺失IDR1的突变体（AD1， AD3， AD5）无法像野生型Axin1或保留IDR1的AD2那样有效地促进磷酸化。
细胞实验进一步巩固了这一结论。在Axin1敲除的HEK293T细胞中，回补表达野生型Axin1或AD2（保留IDR1）能有效促进β-catenin的磷酸化并降低其蛋白水平，从而抑制Wnt信号报告基因的活性。而缺失IDR1的Axin1突变体则丧失了这些功能，甚至表现出一定的显性负效应，导致基础Wnt信号升高。最后，在非洲爪蟾胚胎这一经典的发育生物学模型中，注射野生型Axin1或AD2的mRNA会导致胚胎出现腹侧化表型（即抑制了背侧化所需的Wnt信号），而缺失IDR1的突变体则不能有效产生这一表型，甚至产生相反的背侧化表型。这从活体动物水平证实了Axin相分离特性对于其正确调控Wnt/β-catenin信号通路至关重要。
基于以上详实的数据，本研究得出明确结论：支架蛋白Axin通过其IDR1区域发生液-液相分离；这一相分离过程被其搭档蛋白APC所增强；所形成的Axin凝聚物作为一个高效的组装平台，将GSK3β、CK1α和β-catenin招募并浓缩其中，从而极大地促进了GSK3β对β-catenin的序贯磷酸化，最终导致β-catenin被高效降解。因此，相分离是β-catenin破坏复合体得以组装和发挥功能的核心机制，对于精确调控Wnt/β-catenin信号转导至关重要。
这项研究的科学价值与应用意义重大。首先，它在机制层面取得了重要突破，首次为“破坏复合体通过相分离组装”这一长期存在的猜想提供了坚实的实验证据，将相分离这一新兴的细胞组织原理与一个极其重要且保守的信号通路直接联系起来，为理解细胞如何通过生物物理机制调控信号转导的效率和特异性提供了全新范式。其次，研究具有潜在的疾病关联价值。Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与多种癌症（如结直肠癌）的发生发展密切相关。Axin和APC本身也是重要的肿瘤抑制蛋白。本研究发现其功能依赖于相分离，这提示相分离过程的失调可能与肿瘤发生有关，为未来开发以相分离为靶点的新型抗癌策略提供了理论基础。此外，研究中对IDR关键残基的鉴定，也为相关遗传疾病的致病机制研究提供了线索。
本研究的亮点突出体现在以下几个方面：1. 研究逻辑严谨完整：从现象观察（细胞内点状结构）到体外重建（蛋白液滴），从结构域鉴定（IDR1）到功能验证（磷酸化、信号报告、胚胎表型），形成了一个闭合的证据链。2. 技术创新与多方法整合：娴熟运用了基因编辑（CRISPR/Cas9）、体外相分离重组、FRAP动力学分析、体外酶学 assay、定量质谱以及胚胎显微注射等多种技术，从分子、细胞到个体水平进行全方位验证。3. 发现具有高度新颖性：这是首次系统揭示并证明相分离在Wnt信号通路核心调控机器中的驱动作用，是该领域的标志性进展。4. 对领域具有启发性：研究不仅解决了Axin/APC puncta形成机制的具体问题，更重要的是示范了如何将相分离理论应用于研究传统的多蛋白复合体，为其他信号通路（如Hippo， TGF-β等）中类似支架蛋白的功能机制研究开辟了新思路。
最后，研究也提出了一些值得深入探讨的方向。例如，Wnt配体刺激是如何动态调节破坏复合体相分离状态的？是促进其解离还是改变其组分？此外，Axin1还参与调控JNK、TGF-β等其他信号通路，其相分离特性是否在这些通路中也有类似作用？这些都为未来的研究留下了富有吸引力的空间。这项工作出色地展示了相分离如何作为一种基础的细胞组织原则，来确保关键信号转导事件的精确性与效率，是细胞生物学领域的一项重要成果。