该研究由中国科学院大连化学物理研究所的白帆、蔡鹏、姚伦、申益维、李云霞及周雍进等人完成，发表于 Trends in Biotechnology 2025年3月号（在线发表日期为2025年2月，DOI: 10.1016/j.tibtech.2025.02.005）。该工作构建并优化了一套基于四环素阻遏蛋白（TetR）/tetO2的诱导表达系统，用于在巴斯德毕赤酵母（*Pichia pastoris*，又称 *Komagataella pastoris*）中动态调控同源重组（homologous recombination, HR）相关基因，以提高基因编辑效率，同时避免对细胞生长和产物合成的负面影响。研究通过诱导型表达Rad52和Mus81-Mms4复合物，使单基因无缝敲除和多基因片段组装的正阳性率最高均达到81%，且对以甲醇为碳源的细胞生长和脂肪醇产量无不良影响。
一、学术背景
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养型酵母，广泛用于蛋白质和天然产物的生产。高效构建微生物细胞工厂需要对代谢途径和基因组进行精确编辑，但*P. pastoris*主要依赖非同源末端连接（nonhomologous end joining, NHEJ）修复DNA双链断裂，同源重组效率低，短同源臂（<500 bp）介导的基因打靶率甚至低于0.1%。先前研究表明，过表达HR相关基因（如*RAD52*、*SAE2*、*RAD51*等）可以显著提高基因编辑准确性，但组成型过表达HR基因会干扰细胞自身的重组系统，导致细胞生长迟缓和生产性能下降。为解决这一矛盾，本研究提出利用TetR/tetO2诱导型启动子，在基因工程阶段临时增强HR，而在发酵生产阶段恢复HR基因的正常表达水平，从而实现“高效编辑”和“细胞健康”的协调。
二、研究流程与实验设计
研究首先建立了TetR/tetO2诱导系统。以*P. pastoris*内源组成型启动子PGAP为骨架，在其TATA盒下游8 bp（G1）、31 bp（G2）、52 bp（G3）、73 bp（G4）和94 bp（G5）五个位置分别插入两拷贝tetO2序列，构建重组启动子G1–G5。以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报告基因，将*PADH2-TetR-TDAS1*表达盒整合至PC110菌株的NSI-2位点，评估不同启动子在葡萄糖（G20）和甲醇（M10）培养基中的ATc诱导和TetR抑制强度。结果显示，G2启动子在葡萄糖和甲醇培养基中均表现出最强的ATc诱导效率和最紧的TetR抑制，因此选为优化的Tet-On启动子。
随后，以G2为模板，通过在tetO2插入位点上下游各引入20 bp随机核苷酸序列，构建Tet-On启动子文库。经两轮筛选和测序，获得15个具有不同ATc响应强度的启动子，其诱导强度为PGAP的5%–78%，为后续基因表达水平的精细调控提供了工具。
在HR基因调控实验中，研究者首先将*PADH2-TetR-TDAS1*整合至GS115的NSI-16位点，得到菌株BB060；再将G2启动子驱动的*RAD52*过表达盒整合至HIS4位点，获得菌株BB062。生长曲线实验表明，组成型PGAP-*RAD52*菌株PC110在YPD、G20、M10和M20四种培养基中生长均受抑制，而诱导型BB062的生长与野生型GS115无显著差异。
在CRISPR-Cas9编辑流程中，作者系统优化了ATc添加阶段。通过在摇瓶培养阶段、感受态细胞制备阶段或转化子筛选平板阶段单独或组合添加200 ng/ml ATc，发现仅在平板筛选阶段添加ATc即可获得最高的*gut1*无缝敲除阳性率（81%），与组成型过表达*RAD52*的PC110菌株相当。进一步优化ATc浓度，50 ng/ml即可达到86%–87%的阳性率，且转化子形成单位（CFU/OD600）随ATc浓度升高而下降。利用不同强度启动子表达*RAD52*，发现*RAD52*表达水平与编辑效率正相关，最强启动子G2获得最高的61%阳性率。此外，BB062菌株在50 bp短同源臂条件下*FAA1*敲除阳性率为33%，而野生型GS115在50 bp时几乎无法实现精准编辑。
为扩展可调控的HR基因范围，作者还在BB060中过表达了其他内源和酿酒酵母来源的HR相关基因，如*SCSAE2*、*RAD51*、*SCSRS2*、*SCSGS1*等，发现SCSAE2和RAD51的诱导表达可分别使*gut1*敲除阳性率提高至73%和52%。但联合过表达SCSAE2和RAD51不仅未进一步提高编辑效率，反而严重抑制细胞生长。
在多基因组装方面，研究聚焦于多侵染诱导重排（multi-invasion-induced rearrangement, MIR）途径中的结构选择性内切酶。在BB062菌株（G2-*RAD52*背景）中，分别以不同强度Tet-On启动子过表达*MUS81-MMS4*、*SLX1-SLX4*和*YEN1*，并将包含*MaAFP*、*MmCAR*和*ScADH5*三个表达盒的脂肪醇合成途径同时整合至*FAA1*位点。结果表明，过表达Mus81-Mms4复合物的菌株BB097（强启动子）和BB099（弱启动子）的多基因组装阳性率分别达到69%和81%，显著高于对照BB062的21%；而过表达Yen1或Slx1-Slx4未能提高多基因组装效率。更重要的是，诱导型表达Mus81-Mms4的菌株在不同碳源培养基中的生长均优于组成型过表达Mus81-Mms4的菌株BB110。
三、主要结果与数据支撑
在诱导系统建立阶段，G2启动子在葡萄糖培养基中经ATc诱导后荧光强度达到PGAP的117%，且无ATc时仅为17%；在甲醇培养基中，其激活和抑制水平分别约为PGAP的95%和11%。构建的Tet-On启动子文库诱导强度覆盖PGAP的5%–78%，为差异表达HR基因提供了充足动态范围。
在单基因编辑阶段，BB062菌株的*gut1*敲除阳性率在仅平板诱导条件下最高达81%，与PC110相当；在50 ng/ml ATc条件下，阳性率为86%–87%。不同启动子强度与*gut1*敲除阳性率正相关，最强G2启动子阳性率为61%。短同源臂实验中，BB062在50 bp、100 bp和200 bp同源臂下的*FAA1*敲除阳性率分别为33%、42%和更高水平，而GS115在短同源臂下几乎无法完成精准编辑。
在多基因组装阶段，BB099菌株（弱启动子表达Mus81-Mms4）的阳性率最高，为81%；BB097（强启动子）为69%，BB062对照为21%。此外，诱导型Mus81-Mms4菌株的CFU/OD600显著高于组成型表达菌株，表明诱导策略改善了转化子的存活和生长。
在脂肪醇生产评估中，将*MmFAR*和*ScADH5*整合至GS115、PC110、BB062和BB097中，分别得到BB115、BB111、BB112和BB113。96小时发酵结果表明，诱导型菌株BB112和BB113的脂肪醇产量比组成型HR菌株BB111高1.3倍，同时细胞生长和甲醇消耗也优于BB111。BB114（来源于BB099）虽组装效率高，但脂肪醇产量仅为87 mg/L，具体原因尚待研究。
四、结论与意义
本研究成功在*P. pastoris*中建立了TetR/tetO2诱导型启动子系统，并开发了具有梯度强度的启动子文库。通过动态调控*RAD52*和*MUS81-MMS4*，在CRISPR-Cas9编辑过程中显著提高了单基因敲除和多基因片段组装的效率，同时避免了对细胞生长和产物合成的代谢负担。该策略解决了组成型过表达HR基因导致细胞适应性下降的瓶颈，为非传统酵母的高效基因组工程提供了一种可行的技术方案。
五、研究亮点
第一，构建并优化了适用于*P. pastoris*的TetR/tetO2诱导系统，筛选出G2启动子并扩展为15个成员的启动子文库，诱导强度范围广（5%–78% PGAP），可用于精细调控基因表达。第二，发现仅需在转化子筛选平板中添加低浓度ATc（50 ng/ml）即可高效诱导HR基因表达，简化了操作流程。第三，系统揭示了*RAD52*表达水平与编辑效率的正相关性，并明确了Mus81-Mms4复合物在多片段组装中的关键作用，优于Yen1和Slx1-Slx4。第四，通过动态调控策略，在保证高效编辑的同时维持了细胞生长和脂肪醇生产能力，为工业规模生物制造中的菌株改造提供了理论和技术支持。
六、其他有价值内容
研究还指出，该诱导系统在摇瓶规模验证有效，未来需在生物反应器规模和其他产品类型中进一步评估。此外，该策略有望扩展至其他非传统微生物，用于精确遗传操作和代谢通路的动态调控。在技术层面，启动子文库的随机突变和筛选策略为其他酵母或真菌的诱导启动子开发提供了参考思路。论文还提出了若干待解决问题，包括是否可开发其他转录/翻译诱导系统来调控NHEJ和HR、该系统是否可扩展至其他微生物以及DNA修复机制如何影响细胞代谢等，为后续研究指明了潜在方向。