本研究由Montserrat Vega、David Castillo、Laura de Cubas、Yirong Wang、Ying Huang、Elena Hidalgo及Margarita Cabrera等人完成，主要依托西班牙庞培法布拉大学（Universitat Pompeu Fabra）氧化应激与细胞周期研究组，以及南京师范大学生命科学学院江苏省微生物与基因组学重点实验室等机构。该研究于2022年发表于 BMC Biology 期刊，论文标题为“Antagonistic effects of mitochondrial matrix and intermembrane space proteases on yeast aging”。
衰老是生物体功能逐渐衰退的复杂过程，线粒体稳态的丧失被认为是衰老的重要标志之一。线粒体不仅负责细胞的能量供应，还参与活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的产生与清除、细胞凋亡调控以及多种代谢信号的整合。影响细胞寿命的线粒体相关因素众多，包括呼吸代谢活性、线粒体融合与分裂动态平衡以及线粒体自噬（mitophagy）等。然而，这些因素各自对衰老进程的确切贡献及其相互调控关系尚不清晰。
线粒体拥有独立的蛋白质质量控制系统（Protein Quality Control, PQC），由分子伴侣和ATP依赖性蛋白酶组成。在裂殖酵母（*Schizosaccharomyces pombe*）中，线粒体含有三种主要的蛋白酶：基质中的可溶性蛋白酶Lon1，以及两种膜结合蛋白酶Yme1和Yta12。Yme1的催化结构域面向膜间隙（intermembrane space），属于i-AAA蛋白酶；Yta12的催化结构域面向基质，属于m-AAA蛋白酶。此外，Mgr3作为Yme1识别底物的衔接蛋白参与线粒体膜蛋白的降解过程。这些蛋白酶在维持线粒体蛋白质稳态中发挥关键作用，但其对细胞寿命的具体影响尚缺乏系统性研究。
本研究旨在利用裂殖酵母全基因组缺失突变体库，筛选与时间寿命（chronological lifespan, CLS）相关的线粒体蛋白酶突变体，并通过分析其呼吸活性、线粒体动态变化及线粒体自噬水平，阐明线粒体蛋白质质量控制系统调控衰老的分子机制。
1. 全基因组筛选寿命相关突变体
研究团队使用Bioneer 2.0版本的裂殖酵母缺失突变体库，共包含2818个缺失突变株。所有菌株在含有3%葡萄糖的富营养培养基（YE）中于96孔板内培养，温度维持在30°C。每个培养板中同时设置三个对照菌株：野生型（WT）、短寿命突变体*sty1Δ*和长寿命突变体*pka1Δ*。Sty1是应激反应通路中的MAP激酶，Pka1是营养信号通路中的蛋白激酶A，二者均为已充分研究的寿命调控因子。
从对数生长期开始，每隔2天（第2、4、6、8天）采集细胞样本，利用碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）染色结合流式细胞术检测细胞存活率。PI仅能进入膜通透性增强的死细胞并发出红色荧光，因此可通过荧光信号区分活细胞与死细胞。根据各时间点的存活细胞比例绘制生存曲线，并计算曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）作为衡量寿命的定量参数。
2. 突变体分类与基因本体富集分析
研究者基于对照菌株的生存曲线下面积分布，采用贝叶斯推断模型估计每个突变体属于野生型、短寿命或长寿命分布的概率，进而将突变体归入概率最高的类别。最终鉴定出163个短寿命突变体和309个长寿命突变体。随后使用Metascape平台对全部寿命异常突变体进行基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析，以细胞组分和生物学过程为分类维度，筛选显著富集的生物学功能条目。
3. 线粒体蛋白酶突变体的寿命验证
在初步筛选中，*lon1Δ*和*mgr3Δ*表现出相反的寿命表型，因此研究者进一步纳入了缺失文库中不存在的另外两个线粒体蛋白酶突变体*yme1Δ*和*yta12Δ*进行深入研究。利用流式细胞术和传统的点板存活实验（spot assay）双重验证四个突变体的时间寿命。点板实验的具体流程为：将不同时间点（对数期、第2、5、6天）的培养物按10倍梯度稀释后点在富营养培养基平板上，培养2-4天后观察生长情况。
4. 线粒体呼吸功能分析
为评估线粒体呼吸活性，研究者首先检测了各突变体在低葡萄糖（0.08%）条件下的生长能力——低葡萄糖条件可促进呼吸代谢，因此呼吸缺陷突变体会表现出生长受阻。同时，在3%和0.08%葡萄糖条件下分别测定各菌株的氧消耗速率，使用Hansatech氧电极记录10分钟内的氧气消耗量。
线粒体膜电位（Δψ）通过MitoTracker Red染色结合荧光显微镜检测。MitoTracker是一种依赖于膜电位的荧光染料，其荧光强度可反映线粒体膜电位的相对水平。图像使用Fiji软件进行定量分析，至少统计100个细胞。
5. 线粒体DNA编码蛋白水平检测
为探究呼吸缺陷的分子基础，研究者从各菌株中纯化线粒体，提取蛋白后进行Western blot分析。检测的蛋白包括线粒体DNA（mtDNA）编码的氧化磷酸化（OXPHOS）组分：Cox1、Cox2、Cox3（复合体IV亚基）和Atp6（ATP合酶亚基），以Sdh2-GFP作为上样对照。
6. 线粒体基质H₂O₂水平检测
利用基因编码的过氧化氢探针mts-Hyper7检测线粒体基质中的H₂O₂稳态水平。Hyper7具有两个激发波长（400 nm和499 nm）和一个发射波长（516 nm），其氧化程度可通过双激发荧光比值计算。通过添加50 mM二硫苏糖醇（DTT）作为完全还原对照，1 mM H₂O₂作为完全氧化对照，计算各菌株中探针的基线氧化程度（OxD0）。
7. 线粒体形态与动态分析
为确定线粒体融合/分裂是否影响寿命表型，研究者分析了线粒体动力学相关突变体（*dnm1Δ*、*fis1Δ*、*msp1Δ*）以及线粒体蛋白酶突变体的形态。线粒体形态通过表达线粒体标记蛋白Sdh2-GFP的荧光显微镜观察，并利用MINA软件对线粒体网络进行定量分析，参数为“分支长度总和均值”（summed branch length mean）。此外，研究者将线粒体形态手工分类为五种类型：管状（tubular）、网络状（network）、碎片化（fragmented）、极化（polarized）和念珠状（beads），统计至少100个细胞中各类型的比例。
8. 线粒体自噬检测
线粒体自噬的激活通过Sdh2-GFP的剪切来监测。在线粒体被自噬降解过程中，Sdh2-GFP被运送至液泡，GFP相对抗蛋白酶降解，而Sdh2部分被降解，因此通过Western blot检测游离GFP的出现即可反映线粒体自噬水平。使用抗GFP抗体检测TCA提取物中的GFP和Sdh2-GFP条带，计算GFP/Sdh2-GFP比值作为线粒体自噬的定量指标。此外，通过荧光显微镜观察Sdh2-GFP与液泡标记蛋白Cpy1-mCherry的共定位来验证线粒体自噬。为确定线粒体自噬在寿命调控中的功能，研究者使用了*atg43-1*突变体（线粒体自噬受体Atg43的部分缺失突变）以及*atg8Δ*（自噬核心组分缺失突变）阻断线粒体自噬，并检测其对寿命的影响。
1. 全基因组筛选鉴定出寿命相关突变体
通过对2818个缺失突变体的系统筛选，共鉴定出163个短寿命突变体和309个长寿命突变体。GO富集分析显示，寿命异常突变体显著富集于质膜组织、氧化应激响应、核糖体功能等细胞组分，以及应激反应、细胞周期进程和蛋白质质量控制等生物学过程。值得注意的是，蛋白质质量控制类别中包含两个线粒体蛋白周转相关基因——*lon1*和*mgr3*，二者表现出相反的寿命表型：*lon1Δ*寿命缩短，*mgr3Δ*寿命延长。
2. 线粒体蛋白酶突变体呈现相反的寿命表型
流式细胞术和点板实验均证实，*lon1Δ*和*yta12Δ*为短寿命突变体，而*mgr3Δ*和*yme1Δ*为长寿命突变体。具体而言，Lon1和Yta12的缺失导致细胞在稳定期存活率显著下降，而Mgr3和Yme1的缺失则使细胞存活率明显高于野生型。这一结果揭示了线粒体基质蛋白酶与膜间隙蛋白酶在寿命调控中的拮抗作用。
3. 呼吸活性与寿命呈正相关
在低葡萄糖条件下，短寿命突变体*lon1Δ*和*yta12Δ*表现出严重的生长缺陷，与电子传递链复合体IV亚基缺失突变体*cox6Δ*相当；而长寿命突变体*mgr3Δ*和*yme1Δ*则生长正常。氧消耗测定显示，*lon1Δ*和*yta12Δ*在高、低葡萄糖条件下呼吸能力均显著降低，而*mgr3Δ*和*yme1Δ*的呼吸速率增强，尤以*yme1Δ*在高葡萄糖条件下最为明显。与此一致，*yta12Δ*的线粒体膜电位显著降低，而*yme1Δ*的膜电位升高。
Western blot分析进一步揭示，*lon1Δ*和*yta12Δ*中线粒体DNA编码的OXPHOS蛋白（Cox1、Cox2、Cox3、Atp6）水平显著降低，这可能是其呼吸缺陷的分子基础。相反，*mgr3Δ*和*yme1Δ*中这些蛋白水平与野生型相当。此外，mts-Hyper7探针检测显示，*yta12Δ*线粒体基质中H₂O₂基线水平显著升高（OxD0为0.46，野生型为0.4），*lon1Δ*也有轻微升高，表明短寿命突变体伴随线粒体ROS产生增加。
4. 线粒体动态并非蛋白酶突变体寿命表型的决定因素
在衰老过程中，野生型细胞在高葡萄糖条件下表现出严重的线粒体碎片化，并伴随膜电位下降。融合突变体*msp1Δ*的衰老细胞同样出现碎片化，而分裂突变体*dnm1Δ*和*fis1Δ*则呈现念珠状排列而非典型碎片化。寿命分析显示，*dnm1Δ*和*fis1Δ*寿命显著延长，*msp1Δ*对寿命无影响。
对于线粒体蛋白酶突变体，对数期的*lon1Δ*、*mgr3Δ*和*yme1Δ*与野生型一样呈现管状线粒体，而*yta12Δ*则表现出类似*msp1Δ*的线粒体聚集于细胞极部的表型，提示Yta12可能参与线粒体融合的调控。然而在衰老后，所有蛋白酶突变体均表现出与野生型相同的线粒体碎片化。MINA定量分析显示，*lon1Δ*、*mgr3Δ*和*yme1Δ*的线粒体分支长度与野生型无显著差异。这些结果表明，线粒体融合/分裂的改变不能解释蛋白酶突变体的寿命表型。
5. 线粒体自噬是长寿突变体寿命延长的必要条件
在低葡萄糖（1%）条件下，线粒体自噬在稳定期被显著激活，表现为Sdh2-GFP的剪切和GFP与液泡标记Cpy1-mCherry的共定位。*atg8Δ*突变完全阻断了这一过程，证明其自噬依赖性。*atg43-1*突变体同样完全抑制了低葡萄糖条件下的线粒体自噬，并导致寿命缩短。
关键发现是，长寿命突变体*mgr3Δ*和*yme1Δ*表现出增强的线粒体自噬诱导，其中*mgr3Δ*在高葡萄糖条件下即有线粒体自噬激活。相反，短寿命突变体*lon1Δ*和*yta12Δ*在衰老过程中检测不到线粒体自噬。更为重要的是，在长寿命突变体中引入*atg43-1*阻断线粒体自噬后，*mgr3Δ*和*yme1Δ*的寿命恢复至野生型水平，证明线粒体自噬是这些突变体寿命延长所必需的。而在野生型背景和富葡萄糖条件下，*atg43-1*并不影响寿命，说明线粒体自噬在呼吸增强的背景下（如卡路里限制或长寿命突变体）才是维持长寿的关键。
本研究通过全基因组筛选和系统的线粒体功能分析，揭示了线粒体蛋白质质量控制系统在时间寿命调控中的复杂性。线粒体基质蛋白酶Lon1和Yta12的缺失导致呼吸缺陷、OXPHOS蛋白水平下降、ROS升高以及线粒体自噬丧失，进而缩短寿命；而膜间隙蛋白酶Yme1及其衔接蛋白Mgr3的缺失则增强呼吸活性并激活线粒体自噬，从而延长寿命。
研究提出了一个重要的概念模型：增强的呼吸能力和活跃的线粒体自噬必须协同作用才能实现寿命延长。高呼吸活性保证充足的能量供应，而线粒体自噬则通过清除受损线粒体维持线粒体群体的功能完整性。二者缺一不可——仅有高呼吸而无自噬，或仅有自噬而无充足呼吸，均不足以延长寿命。此外，本研究证实线粒体自噬在卡路里限制和遗传突变背景下的抗衰老作用具有保守性，与线虫、果蝇等模式生物中的发现一致。
该研究的科学价值在于系统阐明了线粒体蛋白酶、呼吸代谢和线粒体自噬之间的功能联系，为理解线粒体稳态调控衰老提供了新的视角。其应用价值在于，线粒体自噬作为抗衰老干预靶点的潜力得到了进一步验证，可能为开发延缓衰老相关疾病的策略提供理论依据。
本研究的突出亮点包括：（1）建立了基于流式细胞术的高通量时间寿命筛选平台，有效区分了真正的衰老表型与单纯的细胞分裂缺陷；（2）发现线粒体基质与膜间隙蛋白酶对寿命的相反调控作用，揭示线粒体内部不同区室的蛋白质质量控制机制在衰老中扮演不同角色；（3）证明线粒体自噬是长寿命突变体寿命延长的必要条件，明确了线粒体自噬在呼吸增强背景下的关键地位；（4）排除了线粒体融合/分裂动态在蛋白酶突变体寿命表型中的直接作用，明确了呼吸与自噬是核心调控因素。此外，研究还意外发现Yta12可能参与线粒体融合的调控，为后续研究提供了新的方向。