本文档属于类型c，即方法学章节，主要描述了一种优化的农杆菌介导（Agrobacterium-mediated）甜菜（Beta vulgaris L.）遗传转化实验方案。以下是核心内容梳理：

一、作者与出版物信息

作者包括Hiroyo Kagami、Masayuki Kurata、Hiroaki Matsuhira等，来自日本研究机构（未明确标注具体单位）。该方案发表于《Agrobacterium Protocols: Volume 1》（Methods in Molecular Biology系列丛书，2015年），DOI编号10.¹⁰⁰⁷⁄₉₇₈-1-4939-1695-5_27。

二、研究背景与目标

1. 科学领域：植物分子生物学与遗传转化技术，聚焦甜菜基因功能研究。
   
2. 背景需求：
   
   • 甜菜是全球两大糖料作物之一，育种需基因功能解析支持。
     
   • 现有转基因方法存在基因型依赖性（genotype-dependent）、重复性差、操作复杂等问题。
     
3. 目标：开发高效、稳定的甜菜遗传转化方案，平均每10个叶外植体（leaf explant）可产生1株转基因植株。

三、实验方案核心流程

1. 无菌苗培养

• 材料：甜菜品系NK-219 MM-CMS（具细胞质雄性不育特性）。
  
• 步骤：
  
  • 种子球（seed ball）硫酸酸化处理，表面消毒后接种于改良MS培养基（modified Murashige-Skoog, MMS）。
    
  • 暗培养（30°C）至发芽，移栽至光照条件（25°C，16h光/8h暗）。
    

2. 外植体增殖与保存

• 关键操作：
  
  • 切取茎尖分生组织（apical meristem）于增殖培养基（含0.1 mg/L BA激素），诱导多芽生成。
    
  • 通过离体克隆繁殖（in vitro clonal propagation）保存优质基因型。
    

3. 愈伤组织诱导与悬浮培养

• 外植体处理：叶片切块（1.5 cm²）接种于含0.25 mg/L BA的MMS培养基，暗培养6-7周。
  
• 悬浮培养：筛选白色疏松愈伤（friable callus），转入液体培养基振荡培养（120 rpm，25°C）。
  

4. 农杆菌转化与共培养

• 菌株与载体：
  
  • 农杆菌LBA4404，携带双元载体pMDC123（含除草剂抗性基因bar或潮霉素抗性基因hyg）。
    
• 感染条件：
  
  • 悬浮细胞与农杆菌共培养3-4天，添加乙酰丁香酮（acetosyringone）增强转化效率。
    

5. 转基因植株筛选与再生

• 抗性筛选：
  
  • 洗涤后细胞接种于含抗生素（meropenem）和选择性药剂（bialaphos/hygromycin）的培养基。
    
• 再生：
  
  • 抗性愈伤转移至再生培养基（含ABA、TIBA激素），光照诱导芽分化（图2g-h）。
    

6. 驯化与春化处理

• 驯化：逐步开盖适应环境，移栽至灭菌土壤。
  
• 春化（vernalization）：5°C低温处理4个月诱导开花，适用于长日照需求品种。
  

四、方案优势与创新点

1. 高效性：转化效率显著高于传统方法（10:1外植体/转基因植株比例）。
   
2. 基因型优化：针对高组织培养响应品系NK-219 MM-CMS，配套离体繁殖技术解决种质保存难题。
   
3. 标准化细节：
   
   • 明确培养基配方（如NH₄NO₃减半、添加MES缓冲剂）。
     
   • 专用器具设计（如广颈锥形瓶改善通气）。
     

五、应用价值

1. 基础研究：支持甜菜基因功能验证（如已用于育性恢复基因Rf的鉴定）。
   
2. 育种实践：加速抗病、高产性状的分子设计育种。
   
3. 技术推广：提供可重复的标准化流程，降低实验室间差异。
   

六、注意事项

• 基因型限制：仅适用于特定高再生能力品系，需预筛选优质个体。
  
• 关键步骤：
  
  • 愈伤质量（白色疏松）决定后续成功率。
    
  • 光照类型（LED/白炽灯）影响开花诱导。
    

七、资助与致谢

研究受日本文部科学省、农林渔业食品产业技术研究资助，并获BRAIN计划支持。

该方案通过优化农杆菌转化与组织培养环节，为甜菜基因工程提供了可靠工具，尤其适用于分子育种与功能基因组学研究。