学术研究报告：大肠杆菌中通过工程化固氮酶组装路径合成氨

第一作者及研究机构
本研究的核心作者团队来自加州大学欧文分校（University of California, Irvine）分子生物学与化学系，包括Joseph B. Solomon、Chi Chung Lee、Yiling A. Liu等，通讯作者为Markus W. Ribbe和Yilin Hu。研究成果于2024年10月发表于《Nature Catalysis》（卷7，页码1130–1141），DOI为10.1038/s41929-024-01229-x。

学术背景
固氮酶（nitrogenase）是自然界中唯一能在常温常压下将氮气（N₂）还原为氨（NH₃）的酶，对农业、能源和环境领域具有深远影响。然而，固氮酶的传统宿主（如固氮菌Azotobacter vinelandii）难以满足工业化需求，因此异源表达（heterologous expression）固氮酶成为研究热点。本研究旨在通过工程化手段，将固氮酶的关键基因组合导入非固氮宿主大肠杆菌（Escherichia coli），实现功能性固氮酶的合成，并验证其催化活性和生物学功能。

研究流程
1. 基因组合设计与表达
- 目标基因选择：从A. vinelandii和Methanosarcina acetivorans中筛选出最小必需基因集（nifH、nifM、nifZ、nifD、nifK、nifE、nifN、nifV、nifB等），用于合成固氮酶的两个核心组分：还原酶组分（Fe蛋白，nifH编码）和催化组分（MoFe蛋白，nifDK编码）。
- 宿主改造：选用大肠杆菌MY21菌株（ΔiscR背景），通过质粒共表达上述基因，并补充钼酸盐（molybdate）和铁源以支持金属簇（metallocluster）的组装。

1. 蛋白质纯化与表征

   • 金属簇分析：通过电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）测定Fe和Mo含量，验证P簇（[Fe₈S₇]）和M簇（[(R-homocitrate)MoFe₇S₉C]）的完整性。
     
   • 电子顺磁共振（EPR）：检测氧化态和还原态固氮酶的信号特征，例如M簇的S=3/2信号（g=4.31, 3.67, 2.01）和P簇的g=11.8信号。
     
   • 活性测定：通过乙炔（C₂H₂）还原实验和氨（NH₃）生成实验评估固氮酶功能，结果显示异源表达的MoFe蛋白（avnifDKec）活性达到天然酶的34%~48%。
     

2. 体内功能验证

   • 固氮生长实验：在限氨培养基中培养工程菌株YM538ee，诱导固氮酶表达后，监测细胞在N₂或Ar气氛下的生长差异。结果显示N₂条件下细胞密度增加26.2%，证实固氮能力。
     
   • 纳米二次离子质谱（NanoSIMS）：使用¹⁵N₂标记实验，检测到工程菌中¹⁵N富集达3.1%（8.4倍于本底值），直接证明¹⁵N₂被还原并整合入生物质。
     
   • 氨外排机制：通过删除氨转运蛋白基因amtB，构建菌株YM559ee，核磁共振（NMR）检测到胞外¹⁵NH₄⁺积累，进一步验证固氮酶的催化产物。
     

主要结果
1. 异源固氮酶的结构完整性：纯化的avnifDKec含有34%的成熟M簇和58%的P簇，EPR和GC-MS证实其结构与天然酶一致。
2. 催化活性：avnifDKec的C₂H₂还原活性为天然酶的38%，且可通过外源M簇补充提升至56%。
3. 生物学功能：工程菌在限氮条件下依赖固氮酶实现生长，¹⁵N富集和氨外排实验提供了直接的代谢证据。

结论与意义
本研究首次在大肠杆菌中成功表达了具有完整功能的固氮酶，突破了非固氮宿主合成复杂金属酶的瓶颈。其科学价值在于：
1. 机制解析：明确了固氮酶异源组装的限速步骤（如L簇向M簇的转化）。
2. 应用潜力：为开发基于固氮酶的生物反应器（bioreactor）提供了原型系统，未来可通过优化宿主代谢或氧保护策略提升效率。

研究亮点
1. 创新方法：采用“分步验证”策略（divide-and-conquer），分别验证P簇和M簇的组装路径，再整合为完整酶系统。
2. 跨物种基因组合：首次将A. vinelandii和M. acetivorans的基因组合用于大肠杆菌，解决了nifB表达难题。
3. 多模态验证：结合金属分析、EPR、NanoSIMS和NMR，提供了从分子到细胞水平的全面证据。

其他价值
研究还揭示了固氮酶对氧的敏感性是大肠杆菌需厌氧培养的主因，未来可通过引入A. vinelandii的氧保护机制（如Shethna蛋白）进一步优化系统。这一成果为转基因植物中固氮酶的引入提供了理论和技术基础。