本研究由Yukinori Kazeto（第一作者及通讯作者）、Hiroshi Suzuki、Yuichi Ozaki和Koichiro Gen共同完成，作者团队来自日本水产研究与教育机构（Japan Fisheries Research and Education Agency）及东京海洋科技大学（Tokyo University of Marine Science and Technology）。研究成果发表于2021年2月的《General and Comparative Endocrinology》期刊（卷306，文章编号113731），标题为《C-terminal peptide (hCTP) of human chorionic gonadotropin enhances in vivo biological activity of recombinant Japanese eel follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone produced in Freestyle 293-F cell lines》。

学术背景

本研究属于鱼类生殖内分泌学领域，聚焦于糖蛋白激素（glycoprotein hormones）——促卵泡激素（FSH）和黄体生成素（LH）在硬骨鱼类生殖调控中的作用。日本鳗鲡（Anguilla japonica）因其在人工养殖条件下性腺发育停滞的特性，成为研究外源性激素诱导配子发生的理想模型。此前研究表明，重组促性腺激素（recombinant gonadotropins, rGTHs）在体内活性不足可能与其糖基化结构（尤其是末端唾液酸化程度）相关。因此，本研究旨在通过引入人绒毛膜促性腺激素C端肽（hCTP）或马绒毛膜促性腺激素C端肽（eCTP）作为额外O-糖基化位点，提升重组激素的半衰期和生物活性，并系统评估其对日本鳗鲡精子发生的诱导效果。

研究流程

研究分为五个核心环节：

1. 重组激素的构建与表达

   • 载体设计：以单链日本鳗鲡FSH和LH基因为模板，通过PCR扩增分别插入hCTP或eCTP序列，构建六种表达载体（rFSH、rFSH-hCTP、rFSH-eCTP、rLH、rLH-hCTP、rLH-eCTP）。
     
   • 细胞表达：采用Freestyle 293-F细胞系（人胚胎肾细胞）进行转染，通过镍柱亲和层析纯化重组蛋白。Western blot验证各重组激素的亚基完整性（α和β亚基）。
     

2. 糖基化结构分析

   • 凝集素印迹（lectin blot）：使用特异性凝集素（GNL、SNL、MAL、DSL、PNL）检测N-糖基化和O-糖基化类型。结果显示，所有重组激素均含高甘露糖型和复杂型N-糖链，仅含hCTP/eCTP的变体具有唾液酸化O-糖链。
     
   • 液相色谱-质谱联用（LC-MS）：定量分析糖链组成。发现hCTP变体的O-糖链唾液酸化程度显著高于eCTP变体（rFSH-hCTP的唾液酸化O-糖链总量为rFSH-eCTP的2.74倍）。
     

3. 体内药代动力学实验

   • 单次注射实验：35尾雄性鳗鲡分为7组（6种激素+对照组），注射1 mg/kg激素后，在0–168小时内多次采血。ELISA检测血清激素水平显示，rGTH-hCTP组在12–24小时的血药浓度显著高于其他组，且维持时间更长。
     
   • 长期处理实验：另一组35尾鳗鲡每周注射激素，持续6周。时间分辨荧光免疫分析法（TR-FIA）测定血清11-酮睾酮（11-KT）水平，发现rGTH-hCTP组在2–4周诱导的11-KT峰值显著更高。
     

4. 生殖效应评估

   • 性腺体指数（GSI）：长期处理后，rGTH-hCTP组的GSI显著高于对照组及其他变体（如rFSH-hCTP组GSI为对照组的3倍）。
     
   • 组织学分析：仅rGTH-hCTP处理组睾丸出现完整精子发生过程（从精原细胞增殖至精子形成），而其他组仅见早期精原细胞。
     

5. 数据统计

   • 采用Tukey-Kramer检验比较组间差异，显著性阈值设为p<0.05。
     

主要结果

• 糖基化差异：hCTP变体的O-糖链唾液酸化程度更高，与其体内半衰期延长直接相关。
  
• 激素活性：rGTH-hCTP在单次注射后血药浓度更高，且能持续诱导11-KT分泌，而rLH-hCTP在长期处理中表现最优。
  
• 生殖诱导：仅rGTH-hCTP组完成精子发生，证实hCTP通过增强激素稳定性促进生殖细胞成熟。
  

结论与价值

本研究首次揭示hCTP修饰通过增加O-糖链唾液酸化水平，显著提升重组促性腺激素的体内活性。其科学价值在于阐明了糖基化模式与激素功能的关系，为鱼类人工繁殖提供了高效激素设计策略。应用上，rGTH-hCTP可替代传统人绒毛膜促性腺激素（hCG），降低养殖成本并提高精子产量。

研究亮点

1. 技术创新：建立HEK293细胞表达系统生产高糖基化鱼类激素，结合LC-MS精准解析糖链结构。
   
2. 功能验证：通过体内外实验明确hCTP的增效机制，为长效激素设计提供模板。
   
3. 跨物种应用潜力：该策略可扩展至其他经济鱼类的生殖调控研究。
   

其他发现

研究发现HEK293细胞表达的激素唾液酸化程度可能低于CHO细胞，提示未来需优化表达系统以进一步提升活性。此外，研究数据支持“唾液酸化水平与激素半衰期正相关”的理论假设，为糖蛋白激素工程提供了新依据。