本研究由张素玲（Suling Zhang）和吴思宇（Siyu Wu）作为共同第一作者完成，通讯作者为国家兽用药品工程技术研究中心（National Research Center for Veterinary Medicine）的田克恭（Kegong Tian）、西北农林科技大学（Northwest A&F University）的王爱华（Aihua Wang）及国家兽用药品工程技术研究中心的逄文强（Wenqiang Pang）。该论文于2025年发表于*BMC Biotechnology*期刊（文章编号25:112），DOI为10.1186/s12896-025-01049-2。
口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease, FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV）引起的急性、高度接触性传染病，对全球偶蹄动物养殖业造成每年数十亿美元的经济损失。该病毒属于小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒属（Aphthovirus），具有七个血清型（O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3），各血清型内部又存在多种亚型，遗传多样性显著。疫苗接种仍是口蹄疫防控的核心策略，但传统灭活疫苗面临免疫持续期短、生产过程中的生物安全风险以及对新流行变异株适应性不足等挑战。因此，开发更安全、更高效的新型疫苗成为当务之急。
病毒样颗粒（Virus-Like Particles, VLPs）因其能够模拟天然病毒粒子的空间结构且不具备感染性，被认为是极具前景的亚单位疫苗候选形式。FMDV衣壳由VP0、VP3和VP1三种结构蛋白组成，其中VP0在病毒成熟过程中自裂解为VP4和VP2。VP0的N端区域位于衣壳内部，其十四烷基化（myristoylation）在病毒组装中起重要作用，但体外研究表明无十四烷基化的VP0仍具备形成五聚体和类衣壳结构的能力。然而，VP0的N端区域——尤其是甘氨酸残基或其十四烷基化修饰——对VP0在原核表达系统中的可溶性表达具有负面影响。这一矛盾现象提示VP0 N端区域在衣壳组装和稳定性中扮演着复杂而关键的角色。
基于上述背景，本研究旨在系统探究VP0 N端截短对三种衣壳蛋白在大肠杆菌（Escherichia coli, *E. coli*）中的可溶性共表达水平及组装颗粒稳定性的影响，以期建立一种高效、稳定且具有工业化潜力的FMDV VLPs生产平台。
研究团队首先基于已发表的FMDV空衣壳晶体结构（PDB ID: 1BBT）对VP0 N端区域（残基15–40）进行了详细的相互作用分析，鉴定出三个功能上截然不同的相互作用模块：（1）残基15–20与VP1（第37位残基）和VP3（第19位残基）形成关键接触；（2）残基27–33形成α-螺旋，与VP1（残基75–182）和VP3（残基21–23及27–31）相互作用；（3）残基34–40主要与VP3（残基29–35）相互作用。结构分析显示，残基20–40在五聚体界面上的蛋白间相互作用显著多于残基15–20，表明其在衣壳组装中更为重要。基于此，研究者设计了N端依次截短5、10、15和20个氨基酸的四个VP0变体（分别命名为031-VP0 ΔN5、ΔN10、ΔN15、ΔN20），与全长VP3和VP1进行共表达。
研究以FMDV O型P1基因片段（GenBank登录号：JQ973889.1）为模板，经PCR扩增获取N端截短的VP0基因、全长VP3和VP1基因，分别克隆入pETSUMO载体。随后通过多步酶切连接策略将三个表达盒依次整合至pET28b载体，构建单质粒共表达载体pET-VP031。具体而言，先将His6-SUMO-VP0片段插入pET28b获得pET-VP0，再将VP3表达盒经BamHI/SacI位点插入获得pET-VP03，最后将His6-SUMO-VP1表达盒经SalI/NotI位点插入完成pET-VP031构建。其余四个截短变体表达载体采用相同策略构建。重组质粒分别转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中。
将重组菌株在LB培养基中37 °C培养至OD600为0.8时，加入终浓度0.4 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导共表达，28 °C继续培养4小时。菌体经高压匀浆破碎和离心后，取上清液进行ULP1蛋白酶（SUMO蛋白酶）酶切以去除SUMO标签。酶切后的蛋白经Ni Sepharose 6 Fast Flow固定化金属亲和层析（IMAC）纯化，含500 mM咪唑的缓冲液洗脱后透析至组装缓冲液（20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, pH 7.0）中。SUMO标签在4 °C下酶切不同时间（0–12 h），通过SDS-PAGE监测酶切效率，同时以高效分子排阻色谱（HP-SEC）监测VLPs组装进程。酶切完成后通过第二次Ni²⁺亲和纯化去除游离SUMO标签，获得纯化的VLPs。
纯化的VLPs通过以下方法进行系统表征：（1）蔗糖梯度超速离心（10%–30%蔗糖梯度，35,000 rpm离心3.5 h）以检测75S空衣壳颗粒的形成；（2）HP-SEC（TSK G4000 SWXL色谱柱）分析分子尺寸分布及聚集体比例；（3）动态光散射（DLS）测定水合粒径和多分散系数（PDI）；（4）透射电子显微镜（TEM）负染观察颗粒形貌和直径；（5）差示扫描荧光法（DSF）以SYPRO Orange染料测定热变性温度（Tm）；（6）不同NaCl浓度（50–1000 mM）下的盐稳定性实验。
采用四种针对不同中和表位的FMDV特异性单克隆抗体（F21-64识别位点1a/5线性表位；F21-58识别位点2；F21-41识别位点3；F21-18识别近位点4的构象表位），通过间接ELISA检测VLPs表面中和表位的暴露情况。以商业化灭活FMDV疫苗抗原为阳性对照，热变性031 VLPs为阴性对照。
将35头FMDV O型抗体阴性的猪随机分为7组（每组5头）：PBS阴性对照组、灭活FMDV疫苗阳性对照组、031全长VLPs组及四个截短变体VLPs组。VLPs以100 µg/头的剂量与ISA 206佐剂乳化后进行肌肉注射。于免疫后0、2、3、4、5、6周采集血清，采用液相阻断ELISA（LPBE）测定FMDV特异性IgG滴度；第28天采集血清进行病毒中和试验以测定中和抗体效价；第28天分离外周血单个核细胞（PBMCs），通过IFN-γ酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测细胞免疫应答水平。
SDS-PAGE和Western blot分析证实，所有五个构建体（野生型031及四个截短变体）均成功实现了VP0、VP3和VP1在大肠杆菌中的可溶性共表达，酶切后三条多肽的分子量分别约为35 kDa（VP0）、26 kDa（VP3）和23 kDa（VP1），与理论分子量（33,034 Da、23,645 Da和23,198 Da）一致。Western blot显示重组蛋白均能与FMDV阳性血清特异性反应。值得注意的是，SUMO标签在4小时内酶切效率达80%，12小时内完全酶切，VLPs组装在12小时内依次完成从原体（protomer）到五聚体再到完整VLPs的过程。
定量分析揭示，与野生型相比，031-VP0 ΔN10、ΔN15和ΔN20变体的纯化产率提高了2.2–2.6倍（P < 0.001），其中ΔN20的产率最高（275.5 ± 5.0 mg/L），而全长031仅为105.0 ± 5.0 mg/L。三种衣壳蛋白的化学计量比接近1:1:1，与天然FMDV衣壳的理论组成一致。
蔗糖梯度超速离心结果显示所有五个构建体均形成了75S空衣壳颗粒。HP-SEC分析显示所有样品的单分散VLPs保留时间约为15.4 min，但野生型031在约10 min处出现明显的聚集体洗脱峰。值得注意的是，031-VP0 ΔN10、ΔN15和ΔN20的聚集体峰面积明显减少。DLS结果与此一致：截短变体的Z-平均粒径从野生型的36.62 nm下降至28.58–29.88 nm，PDI从0.376下降至0.241–0.259，表明单分散性显著改善。TEM确认所有组别均形成了直径约25 nm的均一球形颗粒。SDS-PAGE和Western blot进一步证实主要洗脱峰中三种结构蛋白以1:1:1的比例共存且免疫反应性良好。
热稳定性分析显示，031-VP0 ΔN10、ΔN15和ΔN20的Tm值分别为50.3 °C、50.5 °C和52.0 °C，显著高于野生型的46.3 °C。其中ΔN20的热稳定性提升最显著（ΔTm = 5.7 ± 0.6 °C, P < 0.001）。盐稳定性实验表明，在500 mM NaCl条件下，031-VP0 ΔN20 VLPs保持92%以上的单分散性，而野生型VLPs在相同条件下超过50%发生聚集。
间接ELISA结果显示，所有截短VLPs均能高效结合四种中和单克隆抗体，包括识别线性表位的F21-64和识别构象表位的F21-58、F21-41、F21-18，表明N端截短未破坏VLPs表面中和表位的构象完整性。这一结果与FMDV O型的结构特征一致——VP0/VP4的N端结构域仅位于衣壳内部，而中和表位主要位于VP1–VP3的表面暴露环上。
动物实验显示，所有VLPs免疫组均产生了时间依赖性增加的FMDV特异性IgG滴度，6周时所有组的几何平均滴度均达到保护阈值。截短变体组的抗体水平略高于野生型031组。病毒中和试验表明，所有VLPs组均产生了与灭活疫苗组相当的高水平中和抗体。在细胞免疫方面，所有VLPs均诱导了T细胞应答，其中031-VP0 ΔN20变体诱导的IFN-γ斑点形成细胞数显著高于野生型VLPs（P < 0.001），表明其具有更强的细胞免疫原性。
本研究系统地证明了对FMDV VP0蛋白N端进行合理截短能够在大肠杆菌中显著提高衣壳蛋白的可溶性共表达效率，同时保持VLPs的组装能力并改善其结构和热稳定性。研究揭示了VP0 N端残基1–20的去除可有效抑制由错误折叠引起的聚集体形成，为解决原核表达系统中FMDV衣壳蛋白异质性聚集问题提供了结构指导的工程策略。在免疫原性层面，截短VLPs——尤其是ΔN20变体——诱导了与灭活疫苗相当的体液免疫应答和显著增强的细胞免疫应答。
本研究建立的VLPs生产平台具有重要的科学和应用价值：在科学层面，该工作深化了对FMDV衣壳组装机制的理解，特别是明确了VP0 N端区域在组装稳定性中的结构贡献，这一发现不同于传统模型中强调pH依赖的VP2/VP3环相互作用的观点；在应用层面，该平台为开发成本效益高、结构均一、热稳定性良好的FMDV亚单位疫苗提供了可靠策略，并可推广至其他血清型及相关小核糖核酸病毒的表达系统开发。
本研究的核心亮点包括：（1）基于晶体结构分析指导的理性截短设计，精准定位了VP0 N端区域中与VP1/VP3相互作用较弱但对蛋白错误折叠影响显著的残基片段；（2）发现截短20个氨基酸（ΔN20）在保持组装能力和抗原性的前提下，同时实现了最高的表达产率（2.6倍提升）、最高的热稳定性（ΔTm = 5.7 °C）和最强的细胞免疫应答；（3）建立了从结构分析、载体构建、表达纯化到多维表征和动物免疫评价的完整研究流程，为VLPs疫苗的工程化优化提供了系统范式。
作者在讨论中指出了研究的若干局限性：首先，缺乏PD50保护力试验的评价；其次，未进行冷冻电镜（cryo-EM）高分辨率结构解析，因而无法从分子层面阐明截短VLPs中蛋白间结合事件的机制细节；第三，VLPs制剂在工业储存条件下的长期稳定性尚未得到系统评估。这些局限性为后续研究指明了方向。