（根据文档内容判断，该文档属于类型a——报告单一原创研究的学术论文）
《Nature》2007年4月发表：TIR1泛素连接酶感知生长素的结构机制研究
一、作者与机构
该研究由美国华盛顿大学医学院药理学系的Xu Tan和Ning Zheng、印第安纳大学生物学系的Luz Irina A. Calderon-Villalobos和Mark Estelle、剑桥大学化学系的Michal Sharon和Carol V. Robinson等团队合作完成，发表于《Nature》2007年4月5日刊（Volume 446）。
二、学术背景
生长素（Auxin）是调控植物生长发育的核心激素，其信号转导依赖于SCF泛素连接酶复合体（SCF-TIR1）介导的Aux/IAA转录抑制蛋白降解。尽管遗传学研究表明TIR1（Transport Inhibitor Response 1）是生长素受体，但TIR1如何感知并响应生长素的分子机制尚不明确。本研究旨在通过结构生物学手段解析TIR1-ASK1复合体的晶体结构，阐明生长素结合与信号激活的分子基础，并探索其对植物激素信号通路的普遍意义。
三、研究流程与实验方法
蛋白制备与复合体组装
- 研究对象：拟南芥（Arabidopsis）全长TIR1与ASK1蛋白。
- 方法：通过杆状病毒-昆虫细胞系统共表达GST标签的TIR1和His标签的ASK1，经谷胱甘肽亲和层析、离子交换和凝胶过滤色谱纯化复合体，最终浓缩至4 mg/mL（2.5 Å分辨率）。
- 创新点：采用昆虫细胞表达系统维持蛋白天然构象，并通过冷冻电镜分析复合体纯度。
晶体结构与复合体解析
- 晶体生长：通过悬滴气相扩散法获得TIR1-ASK1晶体，优化条件为100 mM BTP (pH 6.0)、12% PEG 20,000、200 mM NaCl。
- 衍生数据收集：使用Hg、Au、Pt衍生物进行多同晶置换（MIR），在ALS同步辐射光源BL8.2.1等线站收集数据（分辨率1.8–2.5 Å）。
- 结构解析：利用SOLVE软件定位重原子位点，通过CNS和REFMAC5进行模型搭建与精修，最终获得Rfree=22.3%的原子模型。
生长素与底物肽复合物结构
- 处理组设计：分别解析TIR1-ASK1与天然生长素（IAA）、合成类似物（1-NAA、2,4-D）及Aux/IAA7降解肽（GWPPV序列）结合的复合体结构。
- 创新方法：采用分子置换法（Phaser）解析复合物，首次发现TIR1-LRR结构域中结合肌醇六磷酸（InsP6）辅因子。
功能验证实验
- GST pull-down：验证生长素（50 μM 1-NAA）对TIR1与Aux/IAA7结合的增强作用，证实S462E突变体丧失生长素响应性（图4c）。
- 质谱分析：通过ESI-MS确认InsP6的分子量（660.04 Da），证明其与TIR1的共纯化。
四、主要研究结果
TIR1-LRR结构域的独特构象
- LRR结构域呈现扭曲的“弹簧垫圈”构象，由18个LRR重复单元和C端帽结构组成，其凹面形成结合InsP6的带正电口袋（图2）。
- *意义*：该构象为生长素与底物肽的共同结合提供了拓扑基础。
生长素结合位点的特征
- “分子胶”机制：生长素（IAA）通过羧基与Arg403形成盐桥，吲哚环填充TIR1与Aux/IAA7间的疏水空腔（图4a）。
- 底物协同结合：Aux/IAA7的GWPPV基序覆盖生长素结合位点，形成封闭的疏水核心（图5b）。关键突变（A464E）导致底物结合完全丧失（图4c）。
InsP6的辅助功能
- 质谱与晶体结构证实InsP6通过10个带正电残基（如Arg436、Lys485）锚定在TIR1-LRR中心，稳定Arg403的构象（图3a）。
- *推论*：InsP6可能通过调控TIR1结构影响植物激素信号网络的交叉对话。
泛素连接酶调控的新范式
- 实验表明生长素不诱导TIR1构象变化，而是通过扩展蛋白质界面增强结合（图6），否定了“变构开关”假说。
五、结论与意义
1. 科学价值
- 首次揭示植物激素受体的结构模型，提出“分子胶”调控泛素连接酶活性的新机制。
- 为理解SCF复合物底物识别的多样性提供了进化线索，暗示类似机制可能在动物泛素系统中存在。
- 应用前景
- 设计靶向人类泛素连接酶的小分子激动剂（如修复突变导致的蛋白互作缺陷）。
- 通过结构指导开发新型植物生长调节剂（如优化合成生长素类似物）。
六、研究亮点
1. 结构创新：发现TIR1-LRR的异常扭曲构象及InsP6辅因子，颠覆了LRR蛋白结构的传统认知。
2. 机制突破：阐明生长素“分子胶”作用模式，为小分子调控蛋白互作提供范式。
3. 技术整合：结合X射线晶体学（1.8 Å）、质谱与功能验证，形成多维度证据链。
七、其他发现
- 序列分析显示COI1（茉莉酸受体）可能具有类似TIR1的结构，但生长素结合残基不保守（补充图6），提示激素识别的特异性演化路径。