本文属于类型a，即单一原创研究的学术报告。
本研究的通讯作者为Andrea Pasini和Sébastien Darras，其所属研究机构为法国马赛地中海发育生物学研究所（Institut de Biologie du Développement de Marseille-Luminy, IBDML），该研究所隶属于法国国家科学研究中心（CNRS）与地中海大学（Université de la Méditerranée）。该研究成果于2006年6月27日发表于期刊《PLOS Biology》上，文章标题为《海鞘表皮感觉神经元的形成：对脊索动物外周神经系统起源的启示》（Formation of the Ascidian Epidermal Sensory Neurons: Insights into the Origin of the Chordate Peripheral Nervous System）。
该研究属于发育生物学与进化发育生物学（evo-devo）领域。脊椎动物的外周神经系统（peripheral nervous system, PNS）主要来源于神经嵴（neural crest）和神经基板（placodes），然而其进化起源一直不甚清楚。海鞘（ascidian）属于尾索动物（urochordates），是与脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎脊索动物类群。海鞘幼虫尾部PNS由位于表皮中线（epidermal midlines）的感觉神经元构成，这些神经元被称为尾部表皮感觉神经元（caudal epidermal sensory neurons, CESNs）。以往研究提示海鞘背部中线表皮可能是神经嵴的进化前体，但对其发育机制缺乏系统分析。为此，作者以玻璃海鞘（Ciona intestinalis）为模式，系统研究了其幼虫尾部PNS的细胞和分子发育机制，旨在从进化角度揭示脊椎动物PNS的起源。
研究首先对CESNs的形态与排列方式进行了详细观察。通过β-微管蛋白（β-tubulin）和乙酰化α-微管蛋白（acetylated α-tubulin）免疫染色，研究者发现CESNs的细胞体嵌于表皮内，其长突起延伸至覆盖幼虫的纤维素鳍膜（fin tunic）中。这些神经元除尾尖腹侧存在单个CESN外，其余均成对出现，且成对CESNs的两个细胞核总是位于一条偏离胚胎前后轴的直线上。统计显示，不同幼虫中CESN对的数量在8至20对之间波动，平均为14对（n=74）。通过观察固定和活体胚胎的细胞核排列，作者发现尾部表皮由八条单细胞纵行构成，分别为两条中线行、四条中侧行和两条侧行。结合全胚原位杂交和DAPI染色，作者鉴定出多个在不同表皮行中特异性表达的基因：klf1/2/4特异性表达于背腹中线，hesb表达于中侧行，emx表达于侧行；而β-thymosin-like、etr和pou-IV等基因则特异性表达于CESNs本身。这表明尾部表皮的三种形态学区域分别由特定的遗传程序所界定。
为了理解这种区域化的细胞基础，作者开展了细胞谱系示踪实验。在110-细胞期，作者用DiI逐一标记了除b8.19和b8.17外的所有b系卵裂球，并在尾芽晚期或孵化幼虫期分析其后代的分布。结果显示，进入内侧域的克隆由表皮细胞和数量不等的CESNs组成，而所有非内侧域克隆均恰好包含16个表皮细胞。这说明每个前体细胞在110-细胞期与晚尾芽期之间经历了四轮细胞分裂。在被标记的14个b系卵裂球中，有7个在110-细胞期已经命运限定，而其余7个则参与形成两种不同的表皮域。对于大多数非限定卵裂球，其后代均等分布于两个域，提示一次细胞分裂即可使两个域分离。此外，时间推移共聚焦成像显示，在尾芽中期以后尾部表皮不再发生细胞分裂，只有中线区域存在散在的沿垂直于前后轴平面发生的分裂。由于每对CESNs总是被同时标记，作者推断成对CESNs为姊妹细胞，每个110-细胞期中线前体在尾芽中期产生恒定数量的细胞，随后其中可变数量的细胞经历一次额外的第五次分裂，从而生成CESNs对。
接下来，作者研究了中线命运和CESN形成的诱导信号。将8-细胞期的b4.2卵裂球分离培养后发现，这些外植体发育为不表达中线标志物klf1/2/4的表皮，而表达侧域标志物citb003j16，说明中线命运依赖于来自植物极的信号。用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）或骨形态发生蛋白4（BMP4）处理b4.2外植体，能够诱导乙酰化α-微管蛋白阳性的感觉神经元形成，同时激活klf1/2/4并抑制citb003j16表达。整体胚胎处理实验则揭示了两种信号通路的不同时间窗口：bFGF在8-细胞至32-细胞早期能够诱导异位msxb表达，而BMP4处理在8-细胞期至110-细胞期均可诱导全尾表皮异位表达klf1/2/4。进一步功能实验表明，用U0126抑制丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MEK/ERK）通路从16-细胞期处理会导致背侧中线标志物缺失，而从晚32-细胞期处理则无影响；过表达fgf9/16/20可诱导异位中线标志物表达并抑制侧域标志物emx；注射fgf9/16/20反义吗啉代寡核苷酸（morpholino, MO）则导致背部中线标志物丧失但腹侧不受影响。此外，过表达Nodal抑制剂lefty也能特异性抑制背侧中线形成。这些结果表明背侧中线由fgf9/16/20-ERK-Nodal信号级联在早期诱导。
对于腹侧中线，作者发现BMP信号通路是必需且充分的。过表达bmp2/4或admp均能诱导异位中线命运和CESN形成；过表达noggin或注射smad1/5 MO则导致腹侧中线缺失。在基因组中鉴定的七个BMP配体中，admp在囊胚晚期至原肠胚期表达于未来腹侧中线下方的b系植物极细胞。注射admp MO可完全消除腹侧klf1/2/4表达，且该表型可被过表达pfog::admp构建体所拯救。因此，admp是腹侧中线命运的内源性诱导信号。
在确定中线为神经发生区域后，作者研究了Notch信号在CESN数量调控中的作用。delta2作为Notch配体在散在的中线细胞中表达。电穿孔pfog::venus-su(H)dbm（显性负性Notch效应子su(H)融合蛋白）导致中线域内大量细胞表达b-thymosin-like，而中线域大小和中侧域不受影响。相反，电穿孔pfog::delta2或利用p10.27驱动子过表达激活型Notch胞内域（NICD）则导致CESNs减少或缺失。为确定Notch信号的时间需求，作者在不同发育阶段用γ-分泌酶抑制剂DAPT处理胚胎。结果显示，从早期神经胚处理时，中线域大部分细胞变为etr阳性细胞；从晚期神经胚处理时，形成2至3个etr阳性细胞岛；而从早期尾芽处理则无明显影响。这提示中线域生成额外CESNs的能力随发育逐渐下降，CESN数量调控通过Notch介导的侧向抑制机制实现。
基于上述结果，作者提出了CESN形成的完整模型：尾部表皮来源于8-细胞期b4.2卵裂球，其初始命运为侧域身份；在卵裂和原肠胚阶段，fgf9/16/20部分通过Nodal诱导背侧中线，而admp诱导腹侧中线；随后在神经胚至早期尾芽阶段，中线神经发生区域内通过Notch介导的侧向抑制选择CESN前体；最终每个被选中的前体经历一次终末分裂产生一对CESNs。该研究不仅阐明了海鞘PNS的细胞和分子发育机制，还发现了海鞘尾部中线与脊椎动物正中鳍（median fin）在发育机制上的相似性。作者指出，海鞘背侧中线与脊椎动物神经板边界（neural plate border）共享位置和部分基因表达特征，但缺乏神经嵴和基板的迁移性和多能性。此外，作者提出祖先脊索动物可能同时具有背腹侧神经发生中线和正中鳍，而在脊椎动物进化过程中，腹侧中线的神经发生潜力丧失，背侧则演化出迁移性神经嵴。这些发现为理解脊索动物PNS和正中鳍的进化起源提供了新的视角。