基于CRISPR-Cas的植物启动子编辑：超越基因敲除，迈向精细调控
本文档是发表于《New Phytologist》期刊上的一篇“Tansley insight”文章，题为“Beyond knockouts: fine-tuning regulation of gene expression in plants with CRISPR-Cas-based promoter editing”，作者为Xu Tang和Yong Zhang，通讯作者为Yong Zhang（电子科技大学）。文章于2023年4月21日被接受发表。这是一篇前瞻性的综述/观点文章，旨在系统阐述利用CRISPR-Cas技术进行植物启动子编辑的现状、挑战、策略与未来展望。它并非报告单一原创性研究，而是对领域内现有知识、实践和未来方向的深度分析与整合。因此，遵循类型b的要求进行介绍。
文章主题与核心论点
文章的核心主题是：随着植物基因组编辑领域的快速发展，编辑非编码区——特别是启动子——以精细调控基因表达，正成为一个极具前景的方向。这超越了传统的基因敲除（knockout）策略，旨在通过改变顺式调控元件（cis-regulatory elements, CREs）来获得基因表达水平或模式变化的等位基因，从而创造连续性的数量性状变异，为功能基因组学和分子育种提供强大工具。
文章的主要论点围绕以下几个层面展开：
论点一：启动子编辑在植物改良中具有独特优势和巨大潜力，但其应用面临传统研究方法的局限。
启动子是基因表达时空特异性的关键决定因素，由核心启动子和上游CREs组成。自然变异或人工诱变产生的启动子突变已被证明能显著影响重要农艺性状，例如水稻的衰老速度、必需氨基酸含量、玉米的耐寒性等。因此，创造靶向的启动子突变体对于研究基因功能和分子育种至关重要。
然而，传统研究启动子的方法（如鉴定自然突变体、全基因组关联分析、化学或辐射诱变）存在周期长、成本高、效率低、可预测性差等缺点。这凸显了开发快速、高效、精准的启动子突变体创制技术的迫切性。CRISPR-Cas等基因组编辑技术的出现，为克服这些挑战提供了可能。文章列举了多项成功实践，证明利用TALEN或CRISPR-Cas9编辑启动子可以创造具有新性状的种质资源，例如抗病水稻、番茄果实大小和株型的定量变异、玉米产量相关性状的连续变异，以及打破水稻穗粒数与分蘖数间权衡从而大幅增产的新品种。这些案例表明，启动子编辑能够实现基因表达的“微调”，产生丰富的表型谱，这是简单的基因敲除难以实现的。
论点二：广泛使用的CRISPR-Cas9系统在编辑启动子等非编码序列时存在固有局限性，需要开发和应用多样化的CRISPR-Cas系统。
尽管CRISPR-Cas9是植物基因组编辑的主导工具，但其特性使其在编辑启动子时面临挑战。文章详细分析了这些局限性： 1. 序列偏好性：Cas9偏好识别G-C富集序列，而植物启动子区域通常富含A-T碱基，这限制了可靶向的位点。 2. 编辑产物单一：Cas9主要产生1 bp或小片段插入/缺失（indels）。对于启动子而言，这类小突变可能不足以改变关键CRE的功能，导致大量“沉默”编辑事件，无法有效改变基因表达。 3. 切割特性：Cas9产生平末端双链断裂，修复后变异模式相对固定。 4. 特异性问题：存在因错配导致的脱靶风险。
因此，文章强调，需要探索具有不同特性的CRISPR-Cas核酸酶家族成员，以构建更高效的植物启动子编辑工具箱。文章重点比较了多种核酸酶（图2）： * Cas12a (Cpf1)：作为Cas9的主要补充，其具有显著优势：识别A-T富集的PAM序列（TTTV），更适配启动子区域；切割产生粘性末端，易于产生多核苷酸缺失；crRNA可自我加工，便于多重编辑。研究已证明Cas12a能有效编辑植物中的蛋白质编码基因、microRNA、circRNA及启动子等非编码位点。 * Cas12b (C2c1)、Cas12j (Casφ)、Cascade-Cas3等：这些新发现的核酸酶各有特点，如Cas12b和Cas12j也具有A-T富集PAM偏好，Cascade-Cas3能进行长片段删除（100 bp–100 kb）。它们作为潜在的专用启动子编辑工具值得进一步探索。
文章指出，虽然Cas9和Cas12a是目前最实用、可应对大多数任务的工具，但根据启动子编辑的特殊需求（如偏好A-T序列、需要多核苷酸缺失或大片段删除、高特异性等），其他核酸酶有潜力被进一步开发以满足专业化需求。
论点三：为实现高效的植物启动子编辑，需要发展并综合运用多种编辑策略，而不仅仅是依赖单一位点的NHEJ修复。
文章系统梳理了多种CRISPR-Cas介导的启动子编辑策略（图3），并分析了各自的原理与适用场景： 1. 单/多重向导RNA切割介导的编辑：这是最简单直接的方法。使用单个gRNA可能产生小indels，但效率低；使用多个gRNA可产生多位点indels、大片段删除或混合编辑事件，增加获得有效变异的概率，但可能导致基因型复杂、产生大量无益的大片段缺失。文中提到了CAPE系统，它结合了启动子关键区域评估模型和高效的CRISPR-Cas12a多重编辑系统，能更有效地引入作物数量性状变异，同时避免不利基因型。 2. 同源模板定向修复：通过提供外源供体DNA，在DSB位点引入精确的序列修改，例如在番茄中插入强启动子以驱动基因过表达。但此方法在植物中效率通常较低。 3. Cas调控效应子介导的基因调控：利用催化失活的Cas蛋白（如dCas9）融合转录激活因子（如VP64）或抑制因子（如KRAB），在不改变DNA序列的情况下，通过靶向结合启动子区域来上调或下调基因转录水平。 4. 表观遗传编辑：将dCas蛋白与DNA甲基转移酶（如DNMT3A）或去甲基化酶（如TET1）等表观效应因子融合，特异性改变启动子区域的DNA甲基化模式，从而可逆地调控基因表达。该技术已在拟南芥和水稻中得到应用。 5. 启动子置换与结构变异：利用基因组结构变异（如倒位、重复）来改变内源基因的表达。例如，通过创造倒位实现两个基因启动子的交换，或通过重复使基因表达量大幅提升，从而赋予水稻除草剂抗性。 6. 碱基编辑：由脱氨酶和Cas9切口酶融合而成，可在不产生DSB的情况下实现启动子关键核苷酸的精准转换（如C→T，A→G），适用于点突变的功能研究。 7. 先导编辑：由Cas9切口酶与逆转录酶融合，通过pegRNA提供逆转录模板，可实现靶位点任意类型的核苷酸替换、插入、删除及其组合，理论上能实现启动子序列最灵活的定制化修改。
文章强调，应根据具体的研究目标和启动子特性，选择和优化最合适的编辑工具与策略组合。
论点四：启动子编辑的未来发展面临一系列关键科学与技术挑战，需要多方面的突破。
文章在最后部分展望未来，指出了实现高效、精准植物启动子编辑必须解决的几个核心挑战： 1. 可靠精准的调控元件鉴定：需要发展更可靠的方法来精确识别植物的核心启动子和关键CREs，这是有效靶向编辑的前提。 2. 高效编辑工具箱的开发：针对启动子区域A-T富集、序列复杂度低、元件重复性强、存在DNA高级结构（如G-四链体）、表观修饰和蛋白质结合等可及性问题，需要不断优化CRISPR-Cas核酸酶，提高其特异性、扩展可编辑位点范围、增强对染色质的识别和切割能力。 3. 编辑策略的验证与优化：需要在实际应用中验证和比较不同策略（如多重编辑、大片段操作、表观编辑等）的效率、特异性和适用性。 4. 高通量筛选与评价体系：由于启动子编辑常产生连续、细微的表型变化，建立高效的高通量筛选和表型评价体系对于鉴定和分离所需的编辑事件至关重要。
文章的意义与价值
这篇“Tansley insight”文章具有重要的学术价值和指导意义： 1. 系统性梳理与前瞻分析：文章不仅回顾了启动子编辑的成功案例，更深入剖析了当前主流工具（Cas9）的局限性，系统介绍了包括Cas12a在内的多种替代工具和七大类编辑策略，为研究者提供了全面的“技术地图”。 2. 明确问题与指明方向：文章清晰地指出了启动子编辑领域面临的特有挑战（如序列特性、编辑效率、可及性等），并据此提出了未来研究需要重点突破的科学与技术问题，对领域发展具有明确的导向作用。 3. 连接基础研究与育种应用：文章通篇强调启动子编辑在“精细调控基因表达”和“创造数量性状变异”方面的双重优势，架起了基础功能基因组学研究（解读基因功能）与分子育种实践（创制新种质）之间的桥梁，凸显了该技术的巨大应用潜力。 4. 启发创新思维：文章鼓励研究者超越传统的基因编码区编辑思维，将目光投向占据基因组大部分的非编码调控区域，并倡导根据具体需求个性化选择和组合不同的CRISPR-Cas工具与策略，这对于推动植物基因组编辑向更精细化、多元化和实用化方向发展具有重要的启发意义。
本文是一篇关于植物启动子编辑领域的高质量综述与展望，它论证了该方向的重要性与可行性，厘清了当前的技术格局与瓶颈，并为未来的研究路径提供了清晰的框架，对于相关领域的研究人员具有很高的参考价值。