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超亮RNA激活荧光团的结构导向设计：片段化策略开发Mango II适配体高效成像工具
一、作者与发表信息
本研究由美国国立癌症研究所（NCI）化学生物学实验室的Mo Yang、Peri R. Prestwood等作为共同第一作者，John S. Schneekloth Jr.和Adrian Ferré-D’Amaré（美国国立心肺血液研究所）共同领导，合作团队还包括北卡罗来纳大学Kevin M. Weeks课题组。研究成果于2025年8月发表于*Nature Chemistry*（Volume 17, 1188–1195），论文标题为《Structure-informed design of an ultrabright RNA-activated fluorophore》。
二、学术背景
科学领域：本研究属于RNA化学生物学与荧光成像交叉领域，聚焦于荧光RNA适配体-染料系统（fluorogenic RNA aptamer-ligand systems）的优化设计。
研究动机：
RNA荧光适配体（如Mango系统）可通过结合小分子染料实现RNA标记，但其应用受限于亮度不足、亲和力低及选择性差等问题。尽管已有四代Mango适配体（I-IV）被开发，其配体噻唑橙衍生物（TO1-biotin）的荧光量子产率（quantum yield, QY）仅0.225，且细胞成像信噪比有待提升。
目标：
通过结构导向的片段化筛选策略，设计新型荧光染料，解决以下关键问题：
1. 提升Mango II系统的荧光亮度与亲和力；
2. 阐明染料-RNA相互作用的分子机制；
3. 验证新染料在活细胞RNA成像中的应用潜力。
三、研究流程与方法
1. 结构分析与片段库设计
- 靶标分析：基于Mango II-TO1-biotin复合物的晶体结构（PDB 6C63），使用MolSoft PocketFinder软件鉴定结合口袋的空腔区域，发现TO甲基侧链附近存在可容纳片段的空间。
- 片段库构建：从Enamine公司筛选2,214个含伯胺/羟基的片段，通过小分子微阵列（SMM）技术固定于异氰酸酯修饰的玻片。
2. 高通量片段筛选
- 筛选体系：将带polyA尾的Mango II RNA与Cy5-poly(dT)退火形成复合物，分别在有/无TO竞争条件下孵育于微阵列。
- 数据分析：通过Z-score（阈值=3）和Pearson相关系数（r=0.04）区分竞争性（19个）与非竞争性结合片段（11个）。
3. 片段功能验证
- 荧光增强实验：筛选出6个片段（如F2）可非竞争性增强TO荧光（最高提升116%），通过表面等离子共振（SPR）和WaterLOGSY NMR证实F2与TO协同结合Mango II（KD=450–700 μM）。
4. 染料设计与合成
- 结构优化：将F2片段通过酰胺键连接至TO的苯并噻唑环，合成核心染料SALAD1（结构导向阵列配体1），并制备缺失氟（SALAD3）、吡唑环（SALAD4）等衍生物作为对照。
- 光物理表征：测定激发/发射光谱（λex=511 nm, λem=540 nm）、斯托克斯位移（29 nm）、荧光增强倍数（1,500倍）及量子产率（QY=0.722）。
5. 晶体结构解析
- 共结晶与衍射：获得Mango II与SALAD1-4复合物的2.85–3.0 Å分辨率晶体结构（PDB 8Vxx-8Vxz）。
- 结合模式：SALAD1通过钾离子配位（3.1 Å）和A22碱基构象重排（syn→anti）实现更紧密的结合，埋藏面积达590.4 Ų。
6. 细胞成像验证
- 转染与染色：HEK293T细胞表达mCherry-Mango II x24质粒，固定后分别用2 μM SALAD1或TO1-biotin染色。
- 共聚焦成像：SALAD1信号强度较TO1-biotin提升3.5倍（p<0.0001），且细胞渗透性良好。
四、主要结果与逻辑关联
1. 片段筛选：非竞争性片段F2的发现为染料设计提供关键药效团（吡唑环与氟原子），其协同结合机制通过SPR和NMR验证。
2. 染料优化：SALAD1的亮度（34,139 M⁻¹cm⁻¹）和亲和力（KD=0.69 nM）显著优于TO1-biotin，且选择性结合Mango II（对G4-DNA无交叉反应）。
3. 结构机制：晶体结构揭示SALAD1通过钾离子配位和口袋占据优化实现荧光增强，而缺失关键基团的衍生物（如SALAD4）性能下降。
4. 应用验证：细胞实验证实SALAD1适用于高信噪比RNA成像，为活细胞研究提供新工具。
五、结论与价值
科学意义：
1. 首次将片段化筛选策略应用于RNA荧光染料开发，证明了非共价片段协同作用可提升荧光性能；
2. 揭示了钾离子参与染料结合的全新分子机制，为G4核酸靶向设计提供新思路。
应用价值：
SALAD1-Mango II系统兼具超高亮度（3.5倍于传统系统）和亚纳摩尔亲和力，为单分子追踪、多色RNA成像及生物传感器构建提供了优化工具。
六、研究亮点
1. 方法创新：结合SMM高通量筛选与结构生物学指导的染料设计，突破传统π系统修饰的局限。
2. 性能突破：SALAD1的QY（0.722）和亮度达同类最优水平，优于Pepper-HBC（QY=0.53）和BiRHoBaST-TMR2（turn-on=55倍）。
3. 机制发现：首次报道RNA适配体中染料-钾离子相互作用，拓展了核酸-小分子识别理论。
七、其他价值
研究者指出，SALAD1与Mango III的结合亮度更高（但亲和力较低），提示未来可针对不同适配体优化染料，进一步拓宽应用场景。该策略亦可推广至其他RNA靶点（如治疗相关非编码RNA）的配体设计。