Liang Kong、Xiyu Ma、Chao Zhang等作者在2024年2月1日的《Cell》期刊上发表了一项关于植物免疫中脂质信号与活性氧（ROS）调控机制的重要研究。该研究由美国密歇根大学、德克萨斯农工大学、密西西比大学及荷兰阿姆斯特丹大学等多个机构合作完成，通讯作者为Xiyu Ma、Ping He和Libo Shan。研究聚焦于双酰基甘油激酶DGK5通过双重磷酸化介导的磷脂酸（PA）爆发如何调控植物免疫中的ROS产生，揭示了植物模式触发免疫（PTI）和效应子触发免疫（ETI）的协同调控机制。
学术背景
植物通过细胞膜表面的模式识别受体（PRRs）感知病原体相关分子模式（PAMPs），激活PTI；同时通过胞内NLR受体识别病原体效应子，触发ETI。这两种免疫途径均涉及ROS爆发，但其脂质信号调控机制尚不明确。磷脂酸（PA）作为第二信使，在植物应激响应中起关键作用，但其在免疫中的动态调控机制仍是未解之谜。本研究旨在揭示DGK5通过Bik1和MPK4介导的差异磷酸化如何精确调控PA爆发，进而影响ROS产生和植物免疫。
研究流程与实验设计
DGK5与Bik1的互作验证
- 酵母双杂交筛选：以去豆蔻酰化的Bik1（Bik1G2A）为诱饵，从拟南芥cDNA文库中鉴定出DGK5为互作蛋白。
- 体内外互作验证：通过免疫共沉淀（Co-IP）和体外Pull-down实验证实Bik1与DGK5结合；双分子荧光互补（BiFC）和荧光寿命成像（FRET-FLIM）显示两者在质膜上邻近。
- 磷酸化调控：Flg22处理诱导DGK5出现两种磷酸化形式（pDGK5-U和pDGK5-L），Phos-tag凝胶电泳结合质谱分析锁定关键磷酸化位点Ser506（Bik1靶点）和Thr446（MPK4靶点）。
DGK5在PTI中的功能
- 遗传表型分析：DGK5缺失突变体（dgk5-1/dgk5-2）表现出Flg22诱导的ROS爆发减弱、气孔关闭缺陷及对病原菌（Pseudomonas syringae）易感性增加。互补实验证实DGK5-HA可恢复表型。
- 酶活调控机制：体外激酶实验显示，Bik1磷酸化DGK5 Ser506增强其PA合成活性，而MPK4磷酸化Thr446抑制活性。磷酸模拟突变体（DGK5S506D）增强免疫响应，DGK5T446D则削弱响应。
PA与ROS调控的分子机制
- PA-Rbohd轴：Flg22诱导的PA爆发依赖于DGK5，PA通过结合NADPH氧化酶Rbohd的N端碱性区域（R149/150/156/157）抑制其泛素化，稳定Rbohd蛋白水平，促进ROS产生。突变Rbohd的PA结合位点（Rbohd4A）导致蛋白降解加速。
- PTI-ETI协同：DGK5衍生的PA同时参与ETI相关ROS爆发，Flg22预处理的PTI可增强AvrRpt2诱导的ETI响应（ROSpti-eti），而dgk5-1中该协同效应显著减弱。
创新方法
- PA动态监测：首次将FRET生物传感器Paleon（基于Rbohd的PA结合域）用于植物免疫研究，实时检测Flg22诱导的PA时空变化。
- 结构预测：通过AlphaFold2预测Bik1-DGK5和MPK4-DGK5复合物结构，发现磷酸化位点位于非界面区域，提示磷酸化通过变构调节酶活。
主要结果与逻辑链条
- Bik1-DGK5正反馈环路：Flg22激活PRR复合物→Bik1磷酸化DGK5 Ser506→PA爆发→稳定Rbohd→ROS产生→强化免疫（图7i）。
- MPK4-DGK5负调控：MPK4磷酸化DGK5 Thr446→抑制PA合成→防止过度免疫响应。
- 进化保守性：Ser506和Thr446在植物DGK5同源蛋白中高度保守，提示该调控机制在植物界普遍存在。
结论与意义
本研究首次阐明：
1. 双向磷酸化调控：Bik1和MPK4通过差异磷酸化DGK5，精确控制PA爆发幅度，平衡免疫响应与稳态。
2. 脂质-ROS信号枢纽：PA作为“分子开关”直接调控Rbohd稳定性，连接PTI与ETI信号网络。
3. 应用价值：为作物抗病育种提供新靶点（如DGK5磷酸化位点编辑），并为设计PA类似物作为免疫增强剂奠定理论基础。
研究亮点
- 机制创新：发现植物免疫中PA动态调控的“双刃剑”模型（Bik1/MPK4拮抗调控）。
- 技术整合：结合遗传学、脂质组学、活细胞成像及结构预测，多维度解析信号传导路径。
- 理论突破：揭示脂质第二信使与ROS产生的直接偶联机制，填补PTI-ETI协同调控的知识空白。
其他价值
研究还提示DGK5可能整合非生物胁迫（如ABA、盐胁迫）与免疫信号，为植物抗逆研究提供新视角。局限性在于PA细胞区室化检测技术仍需优化，且DGK5是否调控细胞死亡有待验证。