关于酿酒酵母NuA4/Tip60复合物结构的学术研究报告

本研究由Xuejuan Wang (中国科学技术大学，微尺度物质科学国家实验室，生命科学学院；中国科学院分子细胞科学卓越中心)、Salar Ahmad (加拿大拉瓦尔大学圣帕特里克基础肿瘤学研究组，魁北克城CHU研究中心肿瘤学部)、Zhihui Zhang (中国科学技术大学) 以及 Jacques Côté (加拿大拉瓦尔大学) 和 Gang Cai (中国科学技术大学) 共同合作完成。相关研究成果于2018年发表在学术期刊 Nature Communications 上，文章标题为“Architecture of the Saccharomyces cerevisiae NuA4/Tip60 complex”。

一、 学术背景

本研究属于结构生物学与表观遗传学交叉领域。组蛋白乙酰化是至关重要的翻译后修饰，深刻影响染色质功能并调控基因表达、DNA修复和细胞周期进程等关键生物学过程。组蛋白乙酰转移酶(HATs)通常以大型多亚基复合物的形式存在，其中高度保守的NuA4（H4的核小体乙酰转移酶）复合物和SAGA复合物就是典型代表。酿酒酵母中的NuA4复合物由13个独特的亚基组成，分子量高达1.0 MDa，其催化亚基为Esa1（在人类中为Tip60/KAT5）。

NuA4复合物的一个显著特征是它与参与染色质结合和组蛋白修饰反应的其他蛋白质复合物共享多个亚基，例如TRA1（人类TRRAP的同源物）、Act1、Arp4等。其中，Eaf1是唯一在体内专门与NuA4复合物相关的亚基，被证明是协调四个不同功能模块（Piccolo-NuA4、TRA1、Eaf3/5/7以及Arp4/Act1/Swc4/Yaf9）组装的平台。TRA1属于磷脂酰肌醇3-激酶相关蛋白激酶(PIKK)家族，是一个分子量巨大（3744个残基）的假激酶，在NuA4和SAGA复合物中均存在，可能作为复合物组装的支架或招募至染色质的平台。然而，由于NuA4复合物组成复杂、构象灵活，此前对其整体结构和高分辨率架构的了解非常有限，这严重阻碍了对其组装机制、底物识别和功能调控的深入理解。因此，解析NuA4复合物的高分辨率结构，阐明其亚基间的相互作用和组装原理，对于理解其生物学功能以及与之相关的疾病（如癌症，TRRAP/Tip60与多种肿瘤发生相关）机制具有重大意义。本研究的核心目标即是利用冷冻电镜(cryo-EM)技术，解析酿酒酵母NuA4复合物及其关键亚复合物的高分辨率结构，揭示其详细的分子架构和亚基间的相互作用网络。

二、 详细工作流程

本研究的工作流程主要包括复合物的纯化、负染电镜初步分析、冷冻电镜数据收集、图像处理与三维重构、原子模型搭建与修正，以及基于结构预测的功能验证实验。

1. NuA4复合物的纯化与负染电镜初步分析：

   • 研究样本： 使用内源性表达Flag标签标记Esa1亚基的酿酒酵母菌株。从约100克酵母细胞中提取全细胞裂解液。
   • 纯化流程： 采用高效的纯化策略以获得均一的内源性NuA4复合物。首先，通过硫酸铵分级沉淀（30%-55%饱和度）富集含有NuA4的组分。然后，利用抗Flag树脂进行一步亲和层析纯化。为进一步去除微量污染物，采用了离子交换Mono Q柱进行精纯。通过SDS-PAGE分析证实，最终获得了包含所有13个亚基的高度同质的NuA4复合物。
   • 负染电镜分析： 将纯化的复合物应用于碳支持膜，用醋酸铀酰负染，在Tecnai F20电子显微镜上成像。此步骤旨在评估样品制备的均一性，并识别复合物可能存在的不同组成状态。通过对收集的颗粒进行参考自由对齐和分类，研究者识别出两种主要的组成状态（State I和State II）。进一步采用随机锥形倾转技术(RCT)对两种状态分别进行了初步的三维重构，获得了分辨率较低的初始模型。这些模型显示复合物具有类似钻石环状的密度，与已知的TRA1和DNA-PKcs结构相似，为后续高分辨率冷冻电镜数据的处理提供了起始模型。

2. 冷冻电镜数据收集与图像处理：

   • 样品玻璃化： 将纯化的NuA4复合物稀释至合适浓度，应用在Quantifoil R2/1载网上，使用FEI Vitrobot进行快速冷冻。
   • 数据收集： 在配备K2直接电子探测器的FEI Titan Krios 300 kV电子显微镜上收集高分辨率图像。以欠焦范围2.0-3.0 μm进行成像，累计电子剂量约为30 e⁻/Ų，图像像素尺寸为1.3 Å。
   • 图像处理流程： 使用MotionCorr2进行运动校正，CTFFIND4估计对比度传递函数(CTF)参数。使用RELION和Gautomatch进行颗粒挑选，共获得约14.3万个颗粒。使用从负染数据获得的低通滤波至60 Å的初始模型，在RELION中进行三维分类。分类结果明确区分出两种主要的颗粒群体：一个较大的群体（State I， 对应不含Piccolo模块的亚复合物）和一个较小的群体（State II， 对应包含Piccolo模块的复合物）。

3. 高分辨率三维重构：

   • TEEAA亚复合物结构： 从三维分类中选取对应于State I的颗粒子集（共63,197个颗粒）进行三维自动精修和后期处理。最终获得了整体分辨率为4.7 Å的冷冻电镜密度图（基于金标准FSC=0.143准则）。该结构被命名为TEEAA组装体，代表Tra1, Eaf1, Eaf5, Actin, Arp4亚基组成的核心架构。
   • TEEAA-Piccolo复合物结构： 从三维分类中选取对应于State II的颗粒子集（共19,060个颗粒）进行精修，获得了整体分辨率为7.6 Å的冷冻电镜密度图，揭示了TEEAA核心与Piccolo模块（Esa1, Epl1, Yng2, Eaf6） 的结合状态。

4. 原子模型搭建与修正：

   • TRA1模型： 基于DNA-PKcs的晶体结构（PDB: 5LUQ），通过同源建模构建了TRA1的C端FAT激酶域-FATC域。其N端大量的HEAT重复序列则根据二级结构预测和密度特征进行从头建模。最终得到的TRA1模型与已报道的酵母TRA1冷冻电镜结构高度一致。
   • 其他亚基的定位： 将肌动蛋白-核质肌动蛋白相关蛋白4-Swr1 HSA结构域复合物（Actin-Arp4-Swr1 HSA）的晶体结构（PDB: 5I9E）明确对接到密度图的头部区域。Eaf1的HSA和SANT结构域通过同源建模进行构建。Eaf5的结构根据二级结构预测和密度特征进行从头建模。对于7.6 Å的TEEAA-Piccolo结构，将Piccolo模块的晶体结构（PDB: 5J9U）对接到额外的密度中。
   • 模型优化： 所有模型均通过Coot进行手动调整，并使用PHENIX中的实空间精修工具进行优化。最终TEEAA组装体的原子坐标已提交至蛋白质数据库（PDB: 5Y81），密度图提交至电镜数据库（EMD-6815， EMD-6816）。

5. 基于结构预测的功能验证实验：

   • 为了验证结构模型中预测的亚基间相互作用界面，研究者设计并进行了体外和体内的生化实验，重点测试了支架蛋白Eaf1的关键相互作用区域。
   • 体外Pull-down实验： 证实了纯化的天然Eaf5/7/3（Tintin）模块与重组GST标记的Eaf1 N端片段（1-530）结合，而重组His标记的TRA1 C端片段（FRB-PI3K-FATC， 3200-3744）与Eaf1的C端片段（536-982）结合。
   • 体内免疫共沉淀实验： 通过在酵母细胞中表达一系列Eaf1截短突变体，并利用Tap标签纯化（通过Epl1或Eaf5），随后进行Western blot分析。结果确认：Tintin模块的结合依赖于Eaf1 N端的前250个氨基酸；Piccolo模块和SWR1-C共享模块（Arp4-Act1-Swc4-Yaf9）的结合则严格依赖Eaf1的HSA结构域（346-420）；而TRA1与不同Eaf1截短体仍保持结合，提示其存在多重相互作用界面。
   • 点突变验证： 在Eaf1 HSA结构域中引入关键疏水残基的三重突变（L362D, M369D, F373D），完全破坏了其与SWR1-C共享模块的结合，并显著削弱了与Piccolo模块的结合，但未完全消除，表明Piccolo模块也可独立于Arp4/Act1与Eaf1发生相互作用。
   • 生长表型分析： 携带不同Eaf1截短突变体的酵母细胞在含有DNA损伤剂（MMS）、甲酰胺或雷帕霉素的培养基中表现出不同程度的生长缺陷，这些表型与相应亚基/模块的缺失相关联，支持了结构功能关系。

三、 主要研究结果

1. NuA4 TEEAA核心组装体的整体架构：

   • 4.7 Å的冷冻电镜结构显示，TEEAA组装体在形状上可分为三个部分：一个细长的“头部”、一个连接用的“颈部”和一个钻石环状的“躯体”。整体尺寸约为210 Å（直径）x 190 Å（高度）。
   • 密度分配与亚基鉴定： “躯体”部分主要由巨大的TRA1亚基构成，其N端HEAT重复序列和C端FAT-激酶域-FATC域的架构清晰可辨。“头部”密度对应于肌动蛋白（Actin）和核质肌动蛋白相关蛋白4（Arp4）异源二聚体。“颈部”密度则对应于支架蛋白Eaf1。此外，在TRA1的FAT域附近还存在额外的密度，被鉴定为Eaf5。因此，该结构揭示了NuA4复合物中一个稳定的核心亚组装体，它缺乏可动态结合的Piccolo模块、Eaf3/7以及共享的Swc4/Yaf9二聚体。

2. TRA1假激酶域的结构特征：

   • 与DNA-PKcs相比，TRA1的N端HEAT重复序列在三维构象上存在显著差异，两个α-螺旋索彼此靠得更近，这可能导致其功能特异性，例如结合不同的转录因子而非DNA修复蛋白。
   • 关键发现： 尽管TRA1是假激酶，但其激酶域呈现出活性构象的特征。它拥有完全有序的、对催化至关重要的结构元件，包括激活环、催化环和P环。特别值得注意的是，TRA1的激活环含有一段17个残基的插入片段，呈完全伸展的构象，稳定了活性位点。此外，其PRD结构域（PKK调控域）相对于Kα9向外旋转了约45°，为伸展的激活环让出了空间，显著增加了激活环的暴露程度。这些构象特征可能反映了TRA1非催化功能的演化分化和重要性。

3. 亚基间相互作用的分子细节：

   • Eaf1与Actin/Arp4模块： Actin和Arp4位于复合物外围，通过与Eaf1的HSA结构域结合而组装到NuA4中。结构揭示了Eaf1 HSA结构域中关键的疏水残基（如L362, M369, F373; I383, M387, I391）分别与Arp4和Actin表面的疏水口袋发生相互作用，这与Swr1复合物中的相互作用模式类似。Actin上已知影响全局组蛋白H4乙酰化的D2A突变位点（act1-136突变）在结构中处于暴露状态，提示其可能作为与底物相互作用的潜在界面。
   • Eaf1与TRA1的相互作用： Eaf1的SANT结构域通过离子相互作用和氢键紧密地结合在TRA1的LBE和FATC结构域上。具体的，Eaf1 SANT上的带电残基（R691， R690， E698）与TRA1 LBE上的D3605、E3512以及FATC上的R3731形成相互作用网络。此外，Eaf1还与TRA1 FAT域的TRD1区域紧密堆积。这些多重相互作用共同稳定了Eaf1与巨型TRA1亚基的结合。
   • Eaf5与Eaf1/TRA1的相互作用： Eaf5亚基主要由α螺旋构成。它一方面靠近Eaf1高度无序的N端区域（前250个残基），另一方面与TRA1的FAT域（TRD1和TRD2区域）以及环形支架单元（HEAT重复45R-51R）形成广泛的接触界面。这种与Eaf1结合较弱但与TRA1结合广泛的特性，为Eaf5/7/3模块的动态组装提供了弹性。
   • Piccolo模块的组装： 7.6 Å的TEEAA-Piccolo结构显示，Piccolo模块（呈现四螺旋束特征）结合在TRA1的环形支架单元和Eaf1的HSA结构域附近。具体来说，Epl1的C端指向Eaf1 HSA，Yng2则紧贴TRA1的环形支架单元，Esa1与HEAT重复41R紧密接触，而Epl1的N端则堆积在HEAT重复24R上。与不含Piccolo的状态相比，结合Piccolo后Eaf1的构象更加收缩，这种结构可塑性可能有助于将结合在Actin/Arp4模块的核小体底物传递至催化模块。

4. 功能验证结果：

   • 生化实验完全支持了结构模型的预测。Eaf1 N端负责招募Tintin模块，HSA结构域对招募Piccolo和SWR1-C共享模块至关重要。Eaf1 HSA结构域的疏水残基点突变特异性破坏了与SWR1-C模块的结合，并影响了Piccolo的稳定结合。Eaf1 SANT结构域的缺失或关键残基突变对TRA1与复合物的整体结合影响较小，这与TRA1存在多重相互作用界面的结构观察一致，但也可能影响其招募转录因子的功能。

四、 结论与意义

本研究通过高分辨率冷冻电镜技术，首次解析了酿酒酵母NuA4乙酰转移酶复合物核心组装体（TEEAA）及其与催化模块（Piccolo）结合状态的三维结构，系统地阐明了其内部精细的分子架构和亚基间的相互作用网络。

科学价值： 1. 揭示了NuA4复合物的组装原理： 明确了Eaf1和TRA1作为双重支架的核心作用。Eaf1通过其不同的结构域（N端、HSA、SANT）作为平台整合各功能模块；而巨大的TRA1假激酶则提供了广泛的作用表面，用于锚定Eaf5/7/3模块和Piccolo模块，并与转录因子竞争性结合。 2. 阐明了TRA1假激酶的非催化功能的结构基础： 首次在复合物背景下展示了TRA1假激酶域采取活性构象，并具有独特的激活环和PRD构象。这为理解PIKK家族成员中假激酶结构域如何通过构象调控来行使支架或调控功能提供了关键范例。 3. 提供了功能调控的分子机制线索： 结构显示Eaf5的结合界面与转录因子VP16的结合区域重叠，暗示了转录激活因子与染色质修饰模块（Tintin）可能通过竞争结合TRA1来调控NuA4的招募和活性。此外，Eaf1的构象可塑性提示其在底物传递中可能发挥作用。 4. 连接了结构生物学与癌症生物学： 研究将人类癌症中发现的TRRAP（TRA1同源物）突变位点映射到结构上，发现这些突变热点集中在介导NuA4和SAGA组装的界面区域，同时也是翻译后修饰（如乙酰化、磷酸化）的位点。这提示这些致癌突变可能通过破坏HAT复合物的组装和功能来驱动肿瘤发生，为未来开发针对TRRAP支架功能的小分子调节剂提供了潜在靶点和新思路。

五、 研究亮点

1. 方法学创新与突破： 成功建立了从酵母中纯化高度均一的内源性超大分子量NuA4复合物的方法，避免了化学交联和重金属染色可能带来的变形，为获得高质量冷冻电镜样品奠定了基础。
2. 结构解析的里程碑： 获得了NuA4复合物核心部分迄今最高分辨率（4.7 Å）的结构，首次在近原子细节水平上揭示了该复杂多亚基复合物的组装蓝图。
3. 对假激酶领域的重要贡献： 详细揭示了PIKK家族中最大成员之一TRA1的完整结构，特别是其假激酶域呈现活性构象这一反直觉的发现，深化了对假激酶功能机制的理解。
4. 多学科交叉验证： 研究完美结合了高分辨率冷冻电镜结构生物学、同源建模、计算分析以及严谨的生物化学和遗传学功能验证，形成了完整的证据链，使结构预测得到了充分实验支持。
5. 重要的转化医学启示： 将基础结构研究与人类疾病（癌症）相关联，通过对致癌突变的结构定位，为理解肿瘤发生机制和开发新的治疗策略提供了宝贵的结构视角。