关于人类血栓单细胞免疫图谱及免疫血栓溶解新概念的学术研究报告

一、 研究团队、发表期刊及时间

本研究由Kami Pekayvaz、Badr Kilani、Markus Joppich等为主要作者，通讯作者为Kami Pekayvaz、Leo Nicolai和Konstantin Stark。研究团队主要来自德国慕尼黑大学医院、慕尼黑心脏联盟德国心血管研究中心、慕尼黑大学信息学系等多个机构。该研究于2025年5月13日发表在知名免疫学期刊《Immunity》（第58卷，第1343–1358页）上。

二、 学术背景与研究目的

本研究属于血管生物学、免疫学与血栓形成（Thrombosis）交叉的前沿领域，具体聚焦于“血栓炎症”（Thromboinflammation）的免疫细胞机制。尽管大量研究已证实炎症细胞在血栓形成起始阶段的关键促进作用（这一过程被称为“免疫血栓形成”Immunothrombosis），但对于血栓形成后，已形成的血栓微环境中免疫细胞的具体状态、功能及其对血栓命运的调控作用，人们知之甚少。传统观点认为免疫细胞主要加剧血栓形成，但越来越多的证据暗示其可能也具有保护性或促消退功能。特别是在人类血栓中，中性粒细胞和单核细胞含量丰富，但其在血栓微环境中的表型、动态变化和相互作用图谱尚缺乏系统性的、无偏见的单细胞水平解析。

因此，本研究旨在填补这一空白，其核心目标是通过单细胞多组学技术，首次全面绘制人类血栓的免疫细胞景观图，揭示血栓内免疫细胞（特别是中性粒细胞和单核细胞）的异质性、功能状态、发育轨迹及细胞间通讯，并探究它们在血栓形成与消退过程中的具体作用。研究最终提出了“免疫血栓溶解”（Immunothrombolysis）这一新概念，即特定的免疫细胞轴通过获得促纤溶表型来促进血栓的消退。

三、 详细研究流程与方法

本研究采用了从临床样本到体外、体内模型的反向转化医学研究策略，流程严谨且多维度验证。

1. 人类血栓样本的获取与初步表征： 研究首先从32名卒中患者（队列描述见表S1）中获取了脑卒中血栓（血栓切除术取出）及其配对的外周血样本。为确保细胞活性（特别是对中性粒细胞至关重要），建立了快速、标准化的离体处理流程。首先，研究者使用多色流式细胞术对血栓和血液中的免疫细胞亚群进行了整体频率评估，并通过t-SNE降维和FlowSOM无监督聚类分析，初步发现血栓中富含中性粒细胞和单核细胞，且中性粒细胞表现出CD16低表达（CD16lo）和CD16高表达（CD16hi）两种表型。

2. 单细胞转录组与表面蛋白组学测序： 为了深入解析免疫细胞表型，研究对7个血栓和6个配对血液样本进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）和CITE-seq（同时检测转录组和表面蛋白）。这是本研究的关键技术，能够无偏见地绘制细胞图谱。通过UMAP降维和聚类分析，他们详细描绘了血栓与血液中免疫细胞的差异，并重点关注了中性粒细胞和单核细胞。分析揭示了血栓中存在大量在血液中不存在的独特免疫细胞亚群，表明血栓微环境诱导了强烈的表型转变。CITE-seq进一步证实了血小板-白细胞聚集体的存在。

3. 血栓中性粒细胞（TNeutro）的深入解析： 通过对中性粒细胞进行精细的亚群再聚类，研究者识别出13个中性粒细胞亚群。其中，VEGF-Ahi CD16hi的Cluster 2是血栓特异性的。该亚群高表达缺氧诱导因子1α反义RNA3（HIF1A-AS3）、尿激酶型纤溶酶原激活物（PLAU）、尿激酶受体（PLAUR）和血栓调节蛋白（THBD），提示其具有促血管生成和促纤溶的“促消退”表型。相反，其他一些亚群（如SRGNhi Cluster 0, PADI4hi Cluster 5/10）则高表达与中性粒细胞胞外陷阱形成（NETosis）和促血栓形成相关的基因。这种异质性表明血栓中性粒细胞兼具促血栓和促消退的双重功能。细胞轨迹推断（使用scVelo软件）提示，血栓中的促消退中性粒细胞可能由循环中的中性粒细胞前体极化而来。

4. 缺氧诱导促消退表型的机制验证： 基于scRNA-seq发现促消退中性粒细胞高表达缺氧相关基因，研究者在体外用HIF1α稳定剂罗沙司他（Roxadustat）处理人中性粒细胞，成功复现了血栓中观察到的CD16hi向CD16lo表型的转变，并且这些细胞显示出更强的纤维蛋白清除能力。在体内，利用髓系细胞特异性敲除Hif1a的小鼠（Lyz2-Cre; Hif1afl/fl嵌合体小鼠）建立下腔静脉狭窄诱导的血栓模型，发现Hif1a缺失会加重血栓负荷，并减少血栓中PLAUR+中性粒细胞的数量，从而在体内证实了HIF1α信号在髓系细胞中具有血栓保护作用。

5. 血栓单核细胞（TMonos）的表型与功能分析： 流式细胞术显示血栓单核细胞向CD16hi（非经典样）表型转变。对分选出的单核细胞进行批量RNA测序（Prime-seq）证实了NR4A1（非经典单核细胞的关键转录因子）和FCGR3A（编码CD16）的上调。scRNA-seq将单核细胞分为10个亚群，其中多个血栓富集群（如Cluster 0, 3, 4, 6）均表现出NR4A1hi的非经典样表型。这些亚群共同高表达中性粒细胞趋化因子（如CXCL8, CXCL2, CCL2, MIF）以及促纤溶/促消退分子（如PLAUR, THBD, VEGFA/B）。加权基因共表达网络分析（WGCNA）发现，这些功能相关的基因（趋化、促消退、非经典表型）在血栓单核细胞中呈模块化协同上调。体外实验发现，凝血酶激活（而非单纯缺氧）可以诱导单核细胞获得类似的促中性粒细胞趋化的表型。

6. 单核-中性粒细胞轴的体内外功能验证： 单细胞互作组分析显示，血栓内单核细胞与中性粒细胞之间存在强烈的趋化因子介导的通讯，尤其是CXCL8-CXCR1/2轴。为了验证“非经典样单核细胞持续招募中性粒细胞进入已形成的血栓”这一假说，研究采用了创新的体内中性粒细胞命运示踪技术：在小鼠血栓形成时注射绿色荧光标记的抗Ly6G抗体（标记第一波中性粒细胞），48小时后再注射红色荧光标记的抗Ly6G抗体（标记第二波中性粒细胞）。结果发现，在血栓形成72小时后，血栓内主要是第二波（后期浸润）的中性粒细胞，而第一波（早期形成时）的中性粒细胞很少，证明了中性粒细胞在血栓形成后仍被持续招募。 为了探究单核细胞在此招募过程中的作用，研究者构建了NR4A1基因敲除（Nr4a1-/-）的骨髓嵌合体小鼠。NR4A1是维持非经典单核细胞所必需的。实验证实，Nr4a1-/-小鼠循环中Ly6Clo单核细胞缺失，其血栓中的中性粒细胞浸润减少，但NETosis标志物无变化，同时血栓重量增加。这表明NR4A1hi的非经典样单核细胞驱动了中性粒细胞向血栓的持续流入。此外，体外实验中，使用CXCR1/2抑制剂Reparixin处理，可减少中性粒细胞向人工血栓的浸润，并削弱血栓的消退。这些结果共同证明，由NR4A1hi单核细胞通过CXCL8-CXCR1/2轴持续招募中性粒细胞，对于后续的血栓消退至关重要。

7. 小鼠与体外模型的验证： 研究还建立了小鼠下腔静脉狭窄血栓模型，并进行了scRNA-seq分析，发现其免疫细胞组成和表型变化与人类血栓高度相似，验证了该模型可用于模拟人类低血流血栓形成。此外，使用人全血体外生成的人工血栓模型也再现了单核细胞趋化中性粒细胞以及中性粒细胞获得促消退表型的关键特征，为机制研究提供了可控的体外系统。

四、 主要研究结果

1. 人类血栓的单细胞免疫图谱： 研究首次系统绘制了人类血栓的免疫细胞全景图，揭示了以先天免疫细胞（中性粒细胞和单核细胞）为主导的微环境。这些细胞在血栓中经历了显著的、异质性的表型重塑，与它们在循环血液中的对应细胞截然不同。
2. 促消退血栓中性粒细胞亚群的发现： 鉴定出一个血栓特异性的中性粒细胞亚群（VEGF-Ahi Cluster 2），该亚群高表达HIF1A-AS3、PLAU、PLAUR、VEGFA/B等基因，表现出促血管生成和促纤溶的“促消退”表型。该表型可由缺氧微环境（通过HIF1α信号）诱导产生。
3. 血栓单核细胞的“免疫血栓溶解”功能： 血栓中的单核细胞普遍向NR4A1hi的非经典样表型转变。这些细胞不仅自身表达促纤溶分子（如PLAUR, THBD），更重要的是，它们高表达一系列中性粒细胞趋化因子（如CXCL8），构成了一个强大的中性粒细胞招募中心。
4. 持续的中性粒细胞招募与极化轴： 体内命运示踪实验证明，中性粒细胞在血栓形成后仍被持续招募至血栓内部。遗传学和药理学实验表明，这一持续招募过程依赖于血栓内NR4A1hi单核细胞及其分泌的CXCL8等趋化因子。
5. “免疫血栓溶解”概念的提出与验证： 综合以上发现，研究提出了“免疫血栓溶解”的概念：血栓内的非经典样单核细胞（NR4A1hi）获得促消退和中性粒细胞趋化表型，通过CXCL8-CXCR1/2轴持续招募循环中的中性粒细胞进入已形成的血栓；这些新招募的中性粒细胞在血栓的缺氧微环境下，通过HIF1α信号通路极化为具有促纤溶（高表达PLAU/PLAUR）和促血管生成（高表达VEGFA）功能的表型，从而促进血栓的溶解和消退。破坏该轴（敲除Nr4a1或抑制CXCR1/2）会减少中性粒细胞浸润并加重血栓负荷；而增强该轴（稳定HIF1α）则促进血栓消退。

五、 研究结论与意义

本研究得出结论：在已形成的血栓中，存在一个以前未知的、具有保护性功能的先天免疫细胞轴——免疫血栓溶解轴。该轴由NR4A1hi的非经典样血栓单核细胞和HIF1α驱动的促消退血栓中性粒细胞共同构成，通过持续的细胞招募和表型极化，主动促进血栓的消退。

科学价值： 1. 提供了宝贵的资源： 生成了首个全面的人类血栓单细胞免疫图谱数据集，为血管免疫学和血栓研究领域提供了重要的基础资源。 2. 挑战并拓展了现有理论： 超越了“免疫细胞在血栓中 solely 起促炎促栓作用”的传统观点，揭示了免疫细胞在血栓微环境中具有高度的可塑性和功能异质性，其促消退功能对于疾病转归可能至关重要。 3. 提出了新概念： “免疫血栓溶解”概念的提出，为理解炎症与血栓之间的复杂相互作用提供了新的框架，强调了免疫系统在血栓性疾病中具有双向调节潜力。 4. 揭示了新的治疗靶点： 研究指出了NR4A1、HIF1α信号通路、CXCL8-CXCR1/2轴以及PLAU/PLAUR系统等可作为潜在的干预靶点。通过增强内源性的免疫血栓溶解通路，或可开发出能够促进局部血栓溶解而不引起全身性出血风险的新型治疗策略。

六、 研究亮点

1. 研究方法的先进性与系统性： 结合了临床样本单细胞多组学（scRNA-seq, CITE-seq）、批量转录组学（Prime-seq）、高维流式、体内外功能验证模型（基因敲除小鼠、命运示踪、药理学干预）等多种技术，从描述到机制进行了多层次、闭环式验证。
2. 发现的创新性： 首次在人类血栓中系统鉴定了具有明确促纤溶和促血管生成功能的免疫细胞亚群，并阐明了其形成依赖于一个由单核细胞发起、缺氧驱动的细胞间通讯轴。
3. 概念的突破性： 提出“免疫血栓溶解”这一新范式，将免疫细胞的保护性功能整合到血栓性疾病的病理生理过程中，具有重要的理论创新价值。
4. 转化潜力明确： 研究不仅描述了现象，更通过基因工程小鼠和药物干预实验，验证了调控该免疫轴能够影响血栓结局，为未来药物研发指明了方向。

七、 其他有价值的内容

研究也指出了其局限性，例如人类血栓的异质性（病因、年龄、用药等可能影响免疫表型）、不同组学技术的固有局限（如scRNA-seq对血小板和濒死细胞捕获不足）、以及动物/体外模型无法完全模拟人体内复杂环境等。这些坦诚的说明为后续研究提供了清晰的改进方向。此外，研究数据与源代码已在Zenodo平台公开，体现了研究的可重复性和开放性。