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日本沼虾（Macrobrachium nipponense）缺氧响应机制的综合代谢组与转录组分析研究

作者及发表信息
本研究由Lei Xu（第一作者，南京农业大学无锡渔业学院）、Wenyi Zhang、Hui Qiao等8位作者共同完成，通讯作者为Hongtuo Fu（中国水产科学研究院淡水渔业研究中心）。研究成果于2021年12月24日发表于期刊《Antioxidants》（2022年第11卷第36期），论文标题为《Integrated metabolomics and transcriptomic analysis of hepatopancreas in different living status Macrobrachium nipponense in response to hypoxia》。

学术背景
本研究属于水生动物生理学与分子生物学交叉领域，聚焦于甲壳类动物对低氧环境的应激机制。日本沼虾是中国南方重要的经济水产物种，但其对缺氧高度敏感，常导致养殖业重大经济损失。尽管此前研究发现缺氧诱导因子（HIF）等基因在缺氧响应中起关键作用，但仅通过转录组分析存在基因筛选片面性的问题。因此，本研究首次结合代谢组与转录组分析，旨在揭示日本沼虾肝胰腺在不同生理状态（存活、濒死、死亡）下应对缺氧的分子机制，并通过反向代谢物推导发现新的缺氧相关基因。

研究流程与方法
1. 样本准备与处理
- 研究对象：100只健康日本沼虾（体重2.0±0.5 g），分为对照组（6.0±0.5 mg/L溶解氧）和缺氧组（1.0±0.2 mg/L，通过氮气维持）。
- 样本采集：缺氧处理8小时后，采集对照组及存活、濒死、死亡状态虾的肝胰腺各30例，液氮速冻后保存于-80℃。

1. 代谢组学分析

   • 代谢物提取：采用气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF-MS）技术，使用LECO-Fiehn Rtx5数据库进行代谢物鉴定。
     
   • 数据分析：通过主成分分析（PCA）和火山图筛选差异代谢物（DEMs），共检测540种代谢物，其中对照组与死亡组、濒死组、存活组分别存在108、86、48个显著差异代谢物。
     

2. 转录组联合分析

   • 基因验证：基于前期转录组数据（PRJNA656359），筛选与共同差异代谢物相关的12个差异表达基因（DEGs），包括磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）、己糖激酶（HK）等，通过qRT-PCR验证表达趋势。
     
   • 关键基因功能实验：设计两套验证实验：（1）不同氧浓度（1.5–6.0 mg/L）下基因表达分析；（2）缺氧时间梯度（0–24小时）动态监测。
     

3. 统计与生物信息学分析

   • 使用SPSS 20.0进行ANOVA和t检验，KEGG富集分析代谢通路，Chroma TOF 4.3x软件处理原始质谱数据。
     

主要结果
1. 代谢组特征
- 缺氧导致乳酸（lactic acid）和β-丙氨酸（beta-alanine）显著上调，且随生存状态恶化积累加剧（死亡组乳酸含量最高）。
- 32种共同差异代谢物中，18种可注释，涉及糖酵解、氨基酸代谢等通路。

1. 关键基因表达

   • PEPCK家族：4个亚型（PEPCK1–4）中，PEPCK2在缺氧早期显著高表达，提示其在糖异生中的核心作用。
     
   • 免疫相关基因：Wnt5和精氨酸酶（ARG）首次在甲壳类缺氧响应中被发现，其表达模式与哺乳动物缺血损伤模型相似。
     
   • 能量代谢基因：乳酸脱氢酶（LDH）和烯醇酶（ENO）在缺氧6小时达峰值后下降，表明缺氧后期能量代谢受阻。
     

2. 通路富集

   • 死亡组富集81条通路，显著涉及HIF-1信号和氧化磷酸化；存活组仅35条通路，以糖代谢为主。
     

结论与价值
1. 科学意义
- 首次通过多组学联合分析揭示日本沼虾缺氧响应的代谢重编程机制，发现PEPCK是连接转录组与代谢组的关键节点基因。
- 鉴定Wnt5、P5CS等新型缺氧相关基因，拓展了甲壳类低氧适应理论的分子框架。

1. 应用价值
   
   • 为培育耐低氧沼虾品种提供候选基因标记（如PEPCK2）。
     
   • 建立“代谢物-基因”反向筛选范式，弥补传统转录组分析的局限性。
     

研究亮点
1. 方法创新：整合GC-TOF-MS代谢组与RNA-seq数据，开发缺氧状态分阶段的动态分析策略。
2. 发现新颖性：首次报道ARG和Wnt5在甲壳类缺氧中的作用，并提出P5CS/P5CDH拮抗调控假说。
3. 跨物种启示：PEPCK亚型功能分化与哺乳动物缺氧响应保守性，为进化比较研究提供新案例。

其他亮点
研究通过时间梯度和氧浓度梯度实验，证实代谢物（如乳酸）积累与基因表达（如LDH）的时序相关性，为缺氧损伤的早期预警提供潜在生物标志物。