关于农业用三唑类杀菌剂诱导人类病原真菌 Candida tropicalis 产生基因组不稳定性和单倍体细胞的研究报告
主要作者与发表信息 本研究由 Tianren Hu、Qiushi Zheng、Chengjun Cao 等学者合作完成，通讯作者为 Bing Li、Haiqing Chu 和 Guanghua Huang。研究团队主要来自同济大学医学院附属上海市肺科医院、复旦大学华山医院感染科及生命科学学院、西南大学药学院，以及加州大学默塞德分校。该研究发表于 PLOS Biology 期刊，2025 年 4 月 1 日在线发表，文章标题为 “An agricultural triazole induces genomic instability and haploid cell formation in the human fungal pathogen Candida tropicalis”。
学术背景 Candida tropicalis（热带念珠菌）是一种重要的人类机会性致病真菌，可引起浅表感染和危及生命的侵袭性感染，也是医院内念珠菌血症的第二或第三常见病原体。与主要栖息于人类和哺乳动物宿主的 Candida albicans（白色念珠菌）不同，C. tropicalis 广泛分布于土壤、海滩沙地、水果、植物等多种自然环境中。近年来，中国和日本等地区的临床分离株对氟康唑（fluconazole）和伏立康唑（voriconazole）等唑类抗真菌药物的耐药率显著上升，但其原因尚不完全清楚。
唑类药物是临床和农业中广泛使用的抗真菌剂，其作用靶点为真菌麦角甾醇生物合成途径中的 14-α-脱甲基酶（由 CYP51 或 ERG11 编码）。戊唑醇（tebuconazole，TBZ）是一种广泛用于农作物病害防治的三唑类杀菌剂，其在环境和食品中的残留可能对人类真菌病原体产生选择性压力。此前已有研究表明，白色念珠菌在氟康唑暴露下可形成单倍体细胞，而 C. tropicalis 长期被认为是专性二倍体生物。本研究旨在评估 TBZ 对 C. tropicalis 基因组稳定性和耐药性演化的影响，并探索其是否能够诱导单倍体形成。
研究流程与实验方法 本研究首先设计了体外实验演化（in vitro experimental evolution assay）。研究人员选取了 5 株对 TBZ 初始敏感的 C. tropicalis 菌株（包括 3 株环境分离株 E56、E57、E102 和 2 株临床分离株 C23、C155），其 TBZ 的 MIC50 值均为 0.06 μg/mL，同时对氟康唑和伏立康唑也敏感。实验演化流程为：将单菌落接种于含 2% 葡萄糖的 RPMI-MOPS 培养基中，37°C 培养 24 小时后，取 1×10⁶ 个细胞接种至含 0.125 μg/mL TBZ（2×MIC50）的新鲜培养基中，37°C 培养 72 小时。随后按 1:10 比例传代至含相同药物浓度的培养基中，每种浓度下传代 3 次后，将 TBZ 浓度翻倍，逐步提高至 16 μg/mL。最终将培养物涂布于含 16 μg/mL TBZ 的 YPD 平板上，挑取单菌落进行后续分析。共获得 35 株演化菌株。平行进行了无药对照传代。
随后对演化菌株进行了抗真菌药物敏感性试验，采用 CLSI M27 指南的微量肉汤稀释法，检测了 TBZ、氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、卡泊芬净和两性霉素 B 的 MIC50。同时，通过流式细胞术（flow cytometry）检测基因组 DNA 含量以确定倍性，并使用全基因组测序（whole-genome sequencing）进行拷贝数变异（copy number variation，CNV）和杂合性分析。测序数据比对至 C. tropicalis 菌株 MYA-3404 的参考基因组，通过 BWA-MEM、SAMtools、GATK 等工具进行变异检测，并利用自编脚本进行拷贝数分析。
为进一步研究单倍体细胞的生物学特性，研究人员进行了生长曲线测定、多种化学压力条件下的斑点稀释实验、小鼠系统性感染模型中的毒力与真菌负荷评估、白-不透明（white-opaque）形态转换实验、交配实验以及 RNA 测序（RNA-seq）分析。此外，还对单倍体菌株的自发二倍体化（auto-diploidization）频率进行了测定，并分析了已发表的 868 株 C. tropicalis 基因组数据以寻找天然单倍体菌株。
主要研究结果 抗真菌敏感性试验显示，所有 35 株演化菌株均对 TBZ 产生耐药（MIC50 ≥ 4 μg/mL），其中 11 株（31.4%）MIC50 高达 32 μg/mL。更重要的是，所有演化菌株均表现出对临床常用唑类药物（氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑）的交叉耐药，但对卡泊芬净和两性霉素 B 的敏感性无显著变化。此外，演化菌株在无药条件下的生长速率低于亲本菌株，但在含药条件下生长优于亲本，提示存在适应度代价。
流式细胞术和全基因组测序分析发现，演化菌株的倍性变化范围从 1.0n 到 3.1n。大多数菌株发生非整倍体变异，约 5%–16% 的演化菌株为二倍体或接近二倍体，但 CNV 分析表明它们实际上携带节段性重复。令人惊讶的是，研究人员发现了几株潜在的单倍体菌株：E56-hap 仅携带 MTLa 等位基因，而 C23-hap 仅携带 MTLα 等位基因。与亲本二倍体相比，单倍体细胞尺寸显著更小（E56-hap 直径 2.8–3.5 µm 对亲本 3.8–5.2 µm），且在基因组范围内几乎完全丧失杂合性（loss of heterozygosity，LOH）。
拷贝数变异分析显示，染色体 5、6 和 R 的拷贝数增加，而染色体 2 的拷贝数减少。染色体 5 和 6 的节段性重复导致了 TAC1、ERG5 和 ERG11 基因的额外拷贝，这些基因分别编码 ABC 转运蛋白转录激活因子、麦角甾醇脱饱和酶和羊毛甾醇去甲基化酶。实时定量 PCR 证实这些基因在耐药菌株中表达水平显著升高。染色体 2 拷贝数减少区域包含 HMG1、ERG3、ERG26、RCH1 和 ROA1 等参与麦角甾醇生物合成和唑类耐药的基因，这些基因的表达水平在演化菌株中显著降低。
单倍体菌株在液体培养基中生长速率明显低于二倍体亲本，倍增时间延长。在含 NaCl、H₂O₂、荧光增白剂和乙醇的胁迫培养基上，单倍体菌株（尤其是 C23-hap）表现出明显的生长缺陷。在小鼠系统性感染模型中，二倍体菌株在脑、肺和肾中的真菌负荷显著高于单倍体，但在脾脏中单倍体真菌负荷反而更高。在氟康唑预处理的小鼠中，单倍体细胞的存活率普遍高于二倍体。
单倍体菌株仍能形成菌丝，尽管能力弱于二倍体。它们还可在 Lee’s 葡萄糖和 Lee’s GlcNAc 培养基上进行白-不透明转换，形成拉长的 opaque 细胞，且该状态在 25°C 和 37°C 均稳定。通过混合 MTLa 型 E56-hap 和 MTLα 型 C23-hap 的 opaque 细胞，研究人员观察到细胞融合和核融合，定量交配实验显示交配效率为 (7.4 ± 0.8) × 10⁻³。单倍体 opaque 细胞还能与二倍体亲本菌株交配产生三倍体后代。
RNA-seq 分析鉴定了 448 个差异表达基因（fold change ≥ 4），其中 264 个在单倍体中上调，184 个在二倍体中上调。单倍体高表达基因包括 ERG5、ERG6、MDR1、FLU1 等与抗真菌耐药相关的基因；而许多参与碳水化合物和氨基酸代谢的基因在单倍体中下调，与单倍体生长缓慢一致。
单倍体菌株还可以约 0.6%–1.3% 的频率自发二倍体化。自二倍体菌株的细胞大小恢复至二倍体水平，生长速率略高于单倍体但仍显著低于原始二倍体。基因组测序发现单倍体和自二倍体菌株均携带 ERG11 基因 G1390A 突变（导致 Gly464Ser 氨基酸替换），该突变此前已被报道与氟康唑耐药相关。最后，通过对公共数据库中 868 株 C. tropicalis 基因组的分析，研究人员发现两株来自西班牙的菌株 CT20 和 CT21 具有极低的杂合性，流式细胞术证实 CT20 中存在单倍体细胞，说明单倍体状态可能在自然界中存在。
结论与研究意义 本研究首次证明农业用三唑类杀菌剂戊唑醇能够在体外诱导 C. tropicalis 产生广泛的倍性可塑性，包括非整倍体和单倍体细胞的形成。这些演化菌株表现出对临床唑类药物的交叉耐药，提示环境中唑类杀菌剂的使用可能促进了耐药菌株的进化和传播。单倍体 C. tropicalis 细胞虽生长较慢、毒力减弱，但仍保留菌丝形成、白-不透明转换和交配能力，且能自发二倍体化。这一发现打破了 C. tropicalis 作为“专性二倍体”的传统认知，为该物种的遗传学研究提供了新的工具框架，同时也提示环境中唑类污染可能是临床耐药性上升的重要因素之一。
研究亮点 本研究的创新之处在于：首次证实农业唑类杀菌剂可诱导 C. tropicalis 形成单倍体；发现了天然存在的单倍体菌株，表明该现象具有生态学相关性；系统地比较了单倍体与二倍体在生长、毒力、基因表达和交配能力方面的差异；并通过全基因组测序和 RNA-seq 揭示了倍性变化驱动耐药性的分子机制。这些发现对于理解真菌病原体的基因组可塑性、耐药性演化以及环境与临床之间的联系具有重要的科学和公共卫生意义。