本文属于类型a，是一项原始研究。该研究由Alyssa Kallman和Elizabeth E. Capowski（共同第一作者）以及David M. Gamm和Donald J. Zack（共同通讯作者）等人完成，主要作者来自Johns Hopkins University School of Medicine和University of Wisconsin-Madison等机构，文章于2020年发表于Communications Biology期刊。
研究的学术背景围绕视网膜光感受器发育与退行性疾病展开。光感受器丢失是致盲的主要原因之一，但其变性机制尚不完全清楚。神经视网膜亮氨酸拉链（neural retina leucine zipper，NRL）是视杆光感受器发育的关键转录因子，NRL突变可导致增强型S锥综合征（enhanced S-cone syndrome）和视网膜色素变性（retinitis pigmentosa）。小鼠模型已证实Nrl缺失会使视网膜偏向产生S锥细胞，但人类模型中NRL功能缺失的发育与分子机制仍缺乏深入研究。该研究旨在利用患者来源的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）分化的视网膜类器官（retinal organoid），在单细胞水平解析人类NRL缺失对视网膜光感受器发育轨迹的影响，并寻找潜在的锥细胞发育调控因子。
研究流程包括多个层次。首先，研究者获取了一例携带NRL纯合无效突变（c.223dupC，p.L75Pfs*19）患者的成纤维细胞，重编程为iPSC，并选择三个核型正常的克隆（L75Pfs克隆7、9和11）作为实验组，以WA09及两个野生型iPSC系（1013和1581）作为对照。所有细胞系均分化为3D视网膜类器官，并在第100天和第170天等不同阶段收集样本。第一阶段为组织学与免疫细胞化学分析：第100天的类器官显示CRX+/RCVN+光感受器前体细胞的产生在野生型和L75Pfs类器官中相当，但L75Pfs类器官中始终未检测到NRL+视杆细胞；随着光感受器成熟并形成外段，L75Pfs类器官出现S-视蛋白（S-opsin）主导的表型，外核层（outer nuclear layer，ONL）中大量细胞表达S-视蛋白，而ML-视蛋白（ML-opsin）表达细胞比例显著下降。定量统计显示，野生型类器官中ML:S视锥比例为19:1，而L75Pfs类器官反转为1:2，同时视杆标记基因NR2E3+细胞几乎消失。RT-qPCR进一步证实视杆发育基因下调，S-视蛋白表达显著上调。第二阶段为拯救实验：研究者利用慢病毒载体在第90天的L75Pfs类器官中重新导入野生型NRL，结果显示在表达外源NRL的ONL区域内S-视蛋白表达被抑制，并出现了罕见的RHO+细胞，部分RHO蛋白定位到外段，证明NRL缺失确实是该表型的直接原因。第三阶段为单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）：采用Dropseq平台对第100天和第170天的野生型与L75Pfs类器官进行单细胞转录组捕获。第100天获得5294个野生型细胞和4787个L75Pfs细胞，聚类分析显示存在无长突细胞、水平细胞、视网膜神经节细胞、视杆细胞、视锥细胞和Müller胶质细胞等主要视网膜细胞群，其中NR2E3表达细胞几乎全部来自野生型；第170天获得8920个野生型细胞和15447个L75Pfs细胞，进一步识别出双极细胞和两类视蛋白表达的视锥细胞群，即ML/S共表达群和主要表达S-视蛋白的群。研究者将类器官单细胞数据与已发表的人胎儿和成人视网膜单细胞数据进行了Spearman相关性分析，以验证类器官细胞类型与体内对应细胞的相似性。第四阶段为发育轨迹重建：利用Monocle算法对5144个野生型光感受器细胞构建拟时间轨迹，识别出视杆与视锥分叉的节点，并通过差异表达分析鉴定出沿视杆和视锥分支富集的基因；随后将野生型与L75Pfs光感受器细胞合并（共13317个细胞）构建联合轨迹，该轨迹出现9个状态，其中状态5和6为视锥细胞，状态7和8为视杆/视杆样细胞群。通过比较L75Pfs视杆样细胞与野生型视杆和野生型视锥的差异表达基因，进一步鉴定出在L75Pfs类器官中存在两类S-视蛋白表达细胞：一类与野生型视锥几乎无差异，另一类则呈现“视杆/视锥中间态”（cods）的特征，即高表达S-视蛋白但视杆和视锥特异性基因表达均低于相应的野生型细胞。最后，研究者在差异表达基因中筛选出75个转录因子，发现MEF2C在野生型和L75Pfs视锥细胞中的表达均显著高于L75Pfs视杆样细胞和野生型视杆细胞；通过整合人视网膜ATAC-seq数据，发现475个基因具有MEF2C结合位点，其中80%在本数据集的光感受器细胞中表达，且7.2%在野生型视锥与L75Pfs视杆样细胞之间差异表达，均显著高于随机预期。免疫细胞化学进一步证实MEF2C蛋白在野生型和L75Pfs类器官的ARR3+视锥细胞中特异性表达，并在人胎儿视网膜和成年猴视网膜中呈现视锥定位模式。
研究的主要结果表明，L75Pfs人类视网膜类器官在缺乏NRL的情况下，视杆细胞发育被阻断，ONL中出现大量S-视蛋白阳性细胞，ML/S比例严重倒置。重新引入NRL可限制S-视蛋白表达并促进RHO表达，证实表型的因果性。单细胞转录组分析不仅确认了类器官中主要视网膜细胞类型的存在，还发现NRL缺失导致视杆细胞向S-视锥样命运转变，且这种转变并非单一状态，而是形成了至少两种不同的光感受器群体：一类与正常视锥细胞在转录组上几乎无差别，另一类则呈现混合表达模式，即高表达S-视蛋白但缺乏完整的视锥或视杆基因表达谱。该“cods”群体的存在提示NRL并非调控视杆与视锥命运决定的唯一转录因子。MEF2C被发现是潜在的视锥发育调控因子，其在视锥中的富集表达和调控基因的显著富集支持其可能参与人类视锥细胞命运特化或成熟过程。与小鼠研究不同，MEF2C在人类样本中与视锥而非视杆命运相关，提示物种间光感受器命运调控网络存在差异。
该研究的科学价值在于首次在单细胞水平系统描述了人类NRL缺失视网膜类器官的光感受器异常发育，揭示了NRL缺失导致的两类S-视蛋白表达细胞群，并鉴定出MEF2C作为候选的视锥发育调控因子。研究还展示了iPSC来源的视网膜类器官结合单细胞转录组分析在解析人类视网膜发育和疾病机制中的强大能力，为后续研究光感受器命运决定和退行性疾病的分子病理提供了重要平台。应用价值方面，该方法可扩展至其他遗传性视网膜疾病相关基因的功能研究，为筛选恢复光感受器命运或延缓变性的治疗策略提供体外模型。
本研究的亮点包括：使用患者来源的NRL纯合无效突变iPSC，避免了物种差异的影响；结合组织学、慢病毒拯救实验和大规模单细胞转录组测序，形成从表型到机制验证再到分子调控发现的完整研究链条；首次在人类模型中识别出NRL缺失导致的两种S-视蛋白表达光感受器群体，尤其是“cods”样中间态细胞群体；提出MEF2C作为人类视锥发育调控的新候选因子，并整合ATAC-seq数据提供调控证据。此外，研究将类器官转录组与已发表的胎儿和成人视网膜单细胞数据系统比较，验证了类器官作为人类视网膜发育模型的有效性。