本文档为类型a，即单项原始研究的学术论文补充材料。以下是根据文档内容撰写的中文综合报告。

一、研究作者、机构与发表信息

该研究题为《Capsid protein structure, self-assembly, and processing reveal morphogenesis of the marine virophage mavirus》，由Diana Born、Lukas Reuter、Ulrike Mersdorf、Melanie Mueller、Matthias G. Fischer、Anton Meinhart和Jochen Reinstein等人完成。通讯作者为Jochen Reinstein，其邮箱隶属于马克斯·普朗克医学研究所（Max Planck Institute for Medical Research）。该研究发表于《美国国家科学院院刊》（PNAS），文档编号为1805376115。本文档为该论文的补充材料（Supplementary Information），包含补充材料与方法、图S1至S8、表S1至S5以及参考文献。

二、研究背景

本研究属于结构病毒学与病毒形态发生学领域。Mavirus是一种海洋噬病毒体（virophage），寄生在巨型病毒Cafeteria roenbergensis virus（CroV）之内，后者又感染海洋原生动物Cafeteria roenbergensis。Mavirus具有独特的生态学和进化意义，其基因组整合到宿主原生动物基因组中，并可在CroV感染时被激活，从而保护宿主群体。然而，mavirus衣壳蛋白的结构、自组装机制以及成熟过程中的蛋白水解加工尚不清楚。本研究旨在解析mavirus主要衣壳蛋白（Major Capsid Protein, MCP）和五邻体蛋白（Penton Protein）的高分辨率晶体结构，阐明衣壳蛋白自组装形成病毒样颗粒（Virus-Like Particles, VLPs）的过程，并揭示mavirus蛋白酶（Mavirus Protease, MVP）对MCP的位点特异性切割如何驱动衣壳成熟和形态发生。

三、研究流程与实验方法

本研究流程可细分为以下主要步骤：

1. 基因克隆与表达载体构建。 研究者将mavirus的mv17基因（编码五邻体蛋白）和mv18基因（编码MCP）进行大肠杆菌密码子优化，克隆至petM-11载体，获得N端His6标签和TEV酶切位点的融合蛋白表达载体。同时构建了MBP融合表达载体pet-MBP-1a-mv18co。此外，通过PCR扩增获得MCP截短体（MCPδC，残基1–516，即去除C端蛋白酶切割片段后的形式）的表达载体。mavirus蛋白酶基因mv16被克隆至pASK-IBA3c载体，实现无标签表达。为制备VLPs，研究者还构建了prsfDuet-1双表达载体，用于共表达MCP与五邻体蛋白。

2. 蛋白表达与纯化。 MVP在BL21(DE3)大肠杆菌中表达，经阳离子交换层析（SP Sepharose）、阴离子交换层析（MonoQ）和尺寸排阻层析（SEC）三步纯化。五邻体蛋白在BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中表达，经Ni²⁺亲和层析、TEV酶切去除His标签、再次Ni²⁺亲和层析和SEC纯化。全长MCP（FLMCP）表达后经Ni²⁺亲和层析（含ATP洗涤以去除DnaK伴侣蛋白）、TEV酶切、阳离子交换层析（Resource S）和SEC纯化。MCPδC的纯化流程与五邻体蛋白类似，但缓冲液条件有所调整。硒代甲硫氨酸（SeMet）标记的MCPδC和五邻体蛋白也通过相同流程纯化，用于后续的晶体学实验。

3. 病毒样颗粒（VLP）的制备。 将表达MCP（或MCPδC）、五邻体蛋白及MVP的载体共转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后，超声裂解细胞，澄清裂解液经连续蔗糖密度梯度速率区带离心分离VLPs。提取的光散射条带经透析后，通过Capto Core 700柱去除游离衣壳粒等小分子污染物，再经100 kDa截留超滤浓缩和0.1 µm过滤，获得纯化的VLPs。该流程用于制备FLMCP-VLPs、MCPδC-VLPs、FLMCP/Penton-VLPs以及含MVP的VLPs。

4. 天然mavirus病毒粒子的制备。 通过共感染CroV和mavirus于C. roenbergensis培养物中，收获裂解上清，经离心、0.45 µm过滤、切向流过滤（0.2 µm和100 kDa截留）浓缩，再经碘克沙醇密度垫超速离心和蔗糖梯度离心纯化，最终获得天然mavirus粒子。

5. 蛋白酶切割反应与半衰期测定。 将纯化的FLMCP衣壳粒或VLPs与MVP在特定缓冲液中于4 °C孵育，在不同时间点取样进行SDS-PAGE，通过考马斯亮蓝染色和Image Lab软件定量FLMCP条带强度，使用GraphPad Prism软件拟合单相指数衰减曲线，计算FLMCP被MVP加工的半数降解时间（t₁/₂）。对FLMCP衣壳粒、FLMCP-VLPs和FLMCP/Penton-VLPs分别进行了三组独立实验。

6. 质谱鉴定MCP切割位点。 FLMCP衣壳粒被MVP完全加工后，经缓冲液置换和反相C8柱液相色谱分离，采用电喷雾电离四极杆飞行时间质谱（ESI-Q-TOF MS）测定完整蛋白和肽段的精确分子量。对C端切割片段（MCPC1-4）进行自动串联质谱（Auto MS/MS）测序，以确定MVP的精确切割位点。同时，通过碰撞诱导解离（CID）确认了MCPδC的N端和C端序列。

7. 晶体学与结构解析。 MCPδC、FLMCP和五邻体蛋白均通过稀疏矩阵筛选获得结晶条件，并利用悬滴蒸汽扩散法优化。SeMet标记的MCPδC和五邻体蛋白晶体用于单波长反常散射（Se-SAD）相位确定。数据在瑞士光源X10SA线站收集，使用XDS软件处理。MCPδC和五邻体蛋白的初始相位由Se-SAD数据通过HKL2MAP和PHASER SAD流程确定。FLMCP的相位通过分子置换（以MCPδC结构为模型）获得。模型经Coot手动构建和REFMAC精修，并使用MolProbity评估模型质量。最终结构已提交至蛋白质数据银行（PDB），编号为6G41、6G42、6G43、6G44和6G45。

8. 其他生物物理与生化分析。 尺寸排阻色谱偶联多角度光散射（SEC-MALS）用于测定蛋白质寡聚状态和摩尔质量。纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）用于测定蛋白质和VLPs的热稳定性，通过荧光比值F350/F330的拐点确定熔解温度（Tm），并通过光散射信号的一阶导数确定衣壳解组装温度（Tdis）。免疫印迹用于检测天然mavirus粒子中的MVP。质谱肽质量指纹图谱（MS PMF）用于确认重组蛋白和天然病毒粒子的蛋白质组成。

四、主要研究结果

1. 衣壳蛋白的寡聚状态。 SEC-MALS结果显示，FLMCP形成三聚体衣壳粒，五邻体蛋白形成五聚体，MVP为单体，MCPδC同样形成三聚体。FLMCP在无MVP时稳定，五邻体蛋白在有无MVP时均稳定，MVP在无衣壳蛋白时稳定。完整质量质谱证实MCPδC的平均中性质量为56953.4459 Da，与理论值偏差仅7.2 ppm。

2. MCP的蛋白酶切割位点。 质谱测序表明，MVP在MCP C端区域进行多位点切割，产生四个C端片段（MCPC1-4）。切割位点位于高度保守的GG│X和GX│G基序中。序列比对显示这些基序在多种噬病毒体MCP中保守存在，包括Sputnik、Zamilon、OLV、DSLV、YSLV4、QLV、TBE和SRHV等。MVP的切割导致MCP C端约50个残基的去除，形成成熟的MCPδC。

3. MCP的结构与切割诱导的构象变化。 FLMCP和MCPδC的晶体结构均显示双果冻卷（double jelly-roll, DJR）折叠。FLMCP和MCPδC的三聚体衣壳粒结构比较揭示了MVP切割引起的显著构象变化：切割后，果冻卷1的核心区域发生压实（compaction），而塔部2（tower 2）发生扩张（expansion）。中央衣壳粒孔道关闭残基M155和T166在MCPδC中发生位移，M155向衣壳外侧移动2.0 Å，T166向三重轴旋转3.0 Å。此外，在FLMCP和MCPδC的三聚体界面处均观察到额外的β-链，形成了基底β-片层（basal interprotomer β-sheet, BIS），其中MCPδC的BIS包含C端双甘氨酸基序（残基509–516）。这些结构变化表明，MVP切割不仅去除了C端肽段，还引发了衣壳粒内部的构象重排，可能促进衣壳粒之间的稳定相互作用。

4. 五邻体蛋白的结构。 五邻体蛋白的晶体结构显示其包含一个单果冻卷（single jelly-roll, SJR）结构域和一个插入结构域（insertion domain, ID）。其拓扑结构与Sputnik五邻体蛋白相似。

5. VLP的自组装与形态发生。 大肠杆菌共表达实验表明，FLMCP可自发组装成VLPs，而MCPδC的组装效率较低。五邻体蛋白的共表达提高了VLPs的产量和规则性。含MVP的共表达系统产生的VLPs中，FLMCP被部分加工为MCPδC，表明MVP在衣壳组装后发挥切割作用。负染色电镜观察到VLPs直径约60–90 nm，形态与天然mavirus粒子相似。

6. 蛋白酶切割动力学。 MVP对FLMCP衣壳粒和VLPs的切割速率不同。在相同条件下，FLMCP-VLPs中FLMCP的降解半衰期短于FLMCP衣壳粒，表明组装状态促进MVP的切割效率。FLMCP/Penton-VLPs中FLMCP的降解半衰期更长，提示五邻体蛋白可能影响MVP的可及性或衣壳的构象状态。

7. 热稳定性分析。 nanoDSF结果显示，FLMCP在pH ≤ 6.0时出现两个解折叠转变（Tm1和Tm2），而MCPδC仅有一个。VLPs的热稳定性高于游离衣壳粒。含五邻体蛋白的VLPs比仅含MCP的VLPs更稳定。含MVP的VLPs中，MCP被切割后热稳定性略有降低，但仍高于游离MCPδC衣壳粒。

8. 天然mavirus粒子的蛋白质组成。 质谱分析确认天然mavirus粒子含有MCP、五邻体蛋白和MVP。免疫印迹也证实了MVP的存在。天然粒子的A260/A280比值为1.36，与含核酸的VLPs（1.29–1.48）相近。

五、结论与研究意义

本研究首次解析了mavirus MCP和五邻体蛋白的高分辨率晶体结构，揭示了MCP的DJR折叠和五邻体蛋白的SJR+ID结构。通过体外蛋白酶切割实验和质谱分析，明确了MVP识别保守的GG│X和GX│G基序，对MCP C端进行多位点切割。结构比较表明，切割引发MCP衣壳粒核心压实和塔部扩张，促进衣壳粒间BIS的形成和稳定，从而驱动衣壳成熟。该研究还建立了大肠杆菌VLP组装系统，证实MCP可自发组装，五邻体蛋白增强组装效率，MVP在组装后切割MCP。这些发现为理解噬病毒体衣壳形态发生的分子机制提供了结构基础，并揭示了病毒衣壳成熟过程中蛋白水解加工与构象变化偶联的普遍原理。此外，保守的切割基序在多种噬病毒体中的存在表明该机制在进化上保守。

六、研究亮点

本研究的亮点包括：（1）首次解析了mavirus衣壳蛋白的高分辨率结构；（2）精确鉴定了MVP的切割位点及保守基序；（3）揭示了切割诱导的衣壳粒构象变化，包括核心压实和塔部扩张；（4）建立了体外VLP组装系统，证实五邻体蛋白和MVP在形态发生中的协同作用；（5）发现组装状态促进MVP切割效率，提示衣壳成熟与组装的动态耦合。

七、其他有价值内容

补充材料还包括Movie S1，展示了FLMCP和MCPδC衣壳粒结构之间的形态变化过程。表S3列出了mavirus MCP与其他DJR蛋白的结构相似性比较，显示与Sputnik MCP的Dali Z值为29.8，序列一致性为17%。表S4列出了各种VLPs和天然粒子的A260/A280比值。表S5列出了克隆所用引物序列。这些资源为后续研究提供了重要参考。