由Magdalena Hümmer, Selin Kara, Andreas Liese, Ina Huth, Jens Schrader和Dirk Holtmann共同完成的一项创新性研究，在学术期刊《Molecular Catalysis》（第458卷，2018年）上发表。该研究团队主要来自德国的两个机构：德西玛研究所工业生物技术部（Industrielle Biotechnologie, DECHEMA-Forschungsinstitut）和汉堡工业大学生物催化技术研究所（Institut für Technische Biokatalyse, Technische Universität Hamburg）。研究旨在开发一种绿色、高效的生物催化新策略，用于合成具有重要商业价值的(-)-薄荷醇脂肪酸酯。
本研究属于生物催化与绿色化学交叉领域，其核心动机源于对可持续和环保化学合成方法的迫切需求。传统上，生物催化在非水介质中转化疏水性底物面临挑战：若选择水相体系，高底物负载量受到限制；若选择有机溶剂，则会带来环境、安全以及产品分离纯化等问题。正如“十二项绿色化学原则”所倡导的，最理想的溶剂就是“无溶剂”。因此，寻找或设计一种既能高效溶解底物、保持酶活性，又无需额外添加有机溶剂、原子经济性高的反应体系，是领域内的重要目标。深共晶溶剂（Deep Eutectic Solvents, DESs）作为一种新型绿色溶剂，因其可调节的物理化学性质、潜在的生物相容性和低毒性而受到广泛关注。此前的研究通常将DESs作为反应介质，并使用其中一种组分作为底物，而另一种组分（如氯化胆碱）仅作为共晶剂，这增加了后续产物分离的难度和成本。受Martins等人关于天然萜烯-单羧酸基疏水性DESs研究的启发，本研究提出了一个新颖概念：直接利用(-)-薄荷醇与脂肪酸（辛酸、癸酸、月桂酸）形成的DES作为反应体系。该DES同时扮演双重角色——既是反应介质，又是底物库。研究目标是在不添加任何有机共溶剂的条件下，实现脂肪酶催化DES自身组分进行酯化反应，从而合成(-)-薄荷醇脂肪酸酯。这一设想若能实现，将首次证明酶可以利用DES的两个组分作为底物进行反应，并完全在“无溶剂”（仅指无外加有机溶剂）条件下进行，有望实现高原子经济性和低环境影响的绿色合成过程。
研究的详细工作流程系统而严谨，主要包括以下几个关键步骤： 首先，是DES的制备与表征。研究选择了三种脂肪酸：辛酸、癸酸和月桂酸，分别与(-)-薄荷醇以特定摩尔比（分别为55:45、65:35和75:25）混合。混合物在42°C下振荡孵育，直至形成均一透明的液体，即得到三种DES：薄荷醇-辛酸DES（ment:oa）、薄荷醇-癸酸DES（ment:da）和薄荷醇-月桂酸DES（ment:dda）。研究通过卡尔费休滴定法测定了这些DES的初始含水量（极低，在0.03%至0.326%之间），并考察了它们在不同外加水量（0、1、5、10 wt%）下的吸水行为。结果显示，加入1 wt%水后，DES相水含量相应增加，体系仍为均相；而加入5或10 wt%水后，DES相水含量达到饱和（约1.9%-2.6%），形成DES相与水相共存的双相体系。这一发现为后续研究水含量对反应的影响奠定了基础。
其次，是脂肪酶的初步筛选。为了评估DES作为溶剂-底物一体化介质的潜力，研究团队在三种不含外加水的“纯”DES中，测试了六种商品化脂肪酶的催化活性。这六种酶包括两种固定化酶（来自南极假丝酵母的CALB，即N435和C-lecta CALB）和四种粉末酶（来自皱褶假丝酵母的CRL、来自洋葱伯克霍尔德菌的BCL、来自洋葱假单胞菌的PCL以及来自荧光假单胞菌的PFL）。反应在35°C、700 rpm搅拌下进行120小时，通过高效液相色谱（HPLC）分析脂肪酸的转化率。筛选结果显示，在所测试的DES中，Candida rugosa lipase (CRL)是唯一表现出显著酯化活性的酶，尤其是在ment:da和ment:dda中观察到了明确的产物峰。而其他几种脂肪酶，包括常用的CALB，在本体系中的活性很低或没有活性。这一关键发现确定了CRL是后续深入研究的理想催化剂。
第三，是深入探究水添加量对CRL催化酯化的影响。基于CRL具有“界面激活”的特性（其活性中心由一个“盖子”结构保护，在疏水-亲水界面处该盖子打开，酶被激活），研究假设向疏水的DES中添加少量水形成双相体系，可能通过提供界面而激活CRL，从而促进反应。因此，研究系统地在三种DES中添加了不同质量分数（0%、1%、5%、10%）的水，考察了这些条件下CRL催化酯化的动力学过程。反应同样在35°C、700 rpm下进行，定期取样并通过HPLC-RID/ELSD联用技术定量分析底物消耗和产物生成。这一步骤是研究的核心实验部分，旨在优化反应条件并理解水在其中的作用机制。
第四，是对最优体系进行工艺表征与参数交互作用研究。在明确了10 wt%水添加对ment:dda体系有积极效果后，研究对该体系进行了详细的工艺参数评估，包括计算批次产率（以g L⁻¹ d⁻¹计）、最终转化率、产物收率以及环境因子（E-factor）。此外，研究还特别考察了搅拌速度（作为界面面积大小的控制因素）与水添加量之间的交互作用。实验设置了不同搅拌速度（100至1500 rpm）和不同水含量（0%、10%、40%）的组合，以探究混合强度如何影响双相体系中的酶催化效率。
在整个研究流程中，数据分析主要依赖于HPLC的定量结果。研究人员开发了使用C8色谱柱的梯度洗脱方法，结合示差折光检测器（RID）和蒸发光散射检测器（ELSD），能够有效分离并定量检测(-)-薄荷醇、脂肪酸及其对应的酯。所有关键产物的结构均通过大气压化学电离液相色谱-质谱联用（APCI-LC-MS）进行了确认。
本研究取得了多项重要且相互关联的结果，这些结果逐步推进并最终支持了研究的核心结论。 在脂肪酶筛选中，CRL在纯DES中的突出活性是第一个关键发现。尽管初始转化率不高（ment:dda中7天达到73%），但它证明了“利用DES双组分为底物进行无溶剂酶促酯化”这一概念的可行性。这一结果为后续优化指明了方向：既然CRL能在纯DES中工作，那么通过工程化手段（如添加水）来提升其活性是可能的。
水添加量影响的实验结果提供了深刻的见解。在ment:oa和ment:da体系中，添加5%或10%的水显著加快了初始反应速率，并提高了7天后的最终转化率（例如，ment:da中从无水的约24%提升到10%水时的83%）。这表明水的存在对CRL在这些DES中的催化有激活作用。然而，在ment:dda体系中，情况略有不同：无水和添加10%水的体系最终转化率和产物浓度无显著差异（均约为71%-62%转化率，对应酯浓度784-957 mM），但都明显优于仅添加1%水的均相体系（仅35.6%转化率）。这说明对于更长链的月桂酸DES，体系本身的特性可能已对CRL有一定激活，而过低的水含量反而不利；而足够的水形成双相界面，同样能提供有效的激活。研究者对此给出了几种可能的解释：1）界面激活效应：在双相体系中，水-油界面使CRL的活性位点暴露，增强催化效率。2）粘度降低：水的加入可能削弱了DES中的氢键网络，降低了介质粘度，从而改善底物扩散和酶活性位点的可及性。3）底物状态：在双相体系中，质子化的脂肪酸底物更倾向于分布在DES相中，而CRL可能偏好催化质子化形式的酸。这些结果之间的逻辑关系表明，水的作用是复杂的，并非简单的线性关系，而是存在一个与DES组成、体系均一性相关的“最优窗口”。
工艺表征结果凸显了该方法的潜在优势。在最优的ment:dda + 10%水体系中，获得了高达957 mM的最终酯浓度和133 g L⁻¹ d⁻¹的批次产率（按24小时计），其环境因子（E-factor）低至1.7。这一E-factor值属于大宗化学品合成的典型范围，表明该工艺的环境友好性。尤其值得注意的是，这一高产物浓度是在完全不使用有机溶剂的情况下达到的，体现了卓越的原子经济性。
对搅拌速度与水含量交互作用的研究揭示了另一个关键工艺参数。在纯DES（0%水）中，搅拌速度对48小时的产物浓度影响不大。然而，在含有10%水的双相体系中，提高搅拌速度能显著增加产物浓度，这归因于更剧烈的混合产生了更大的油水界面面积，从而更有效地激活了CRL。但是，当水含量增加到40%时，即使在高搅拌速度下，产物浓度也未进一步提升，表明在其实验装置中，过高的水含量导致难以形成稳定的DES-水乳液，混合成为了限制因素。这一结果强调了在放大工艺中，反应器设计与混合效率的重要性。
基于以上结果，本研究得出了明确的结论：成功开发并验证了利用(-)-薄荷醇-脂肪酸深共晶溶剂作为“一体化”反应介质与底物库，在无外加有机溶剂条件下，通过CRL脂肪酶催化高效合成(-)-薄荷醇脂肪酸酯的新方法。该研究首次证明，酶促反应可以直接在由反应物自身形成的DES中进行，无需添加任何其他溶剂或共晶剂（如氯化胆碱）。水的添加和搅拌形成的界面是优化该双相反应体系性能的关键因素。这种以共晶反应物混合物为基础的新概念，为疏水性物质的高负载量生物转化提供了一条绿色、高效的新途径，完全符合绿色化学的原则，特别是在预防废物产生、使用安全溶剂、利用可再生原料以及实现高原子经济性方面表现突出。
本研究的亮点和创新之处在于：1）概念创新：提出了“DES即底物”的革命性概念，将DES从单纯的反应介质转变为参与反应的底物来源，彻底避免了外加溶剂和共晶添加剂，简化了下游分离。2）方法创新：成功地将界面激活酶（CRL）应用于疏水性DES-水双相体系，并系统揭示了水含量与混合强度的交互影响，为类似体系的设计提供了重要参考。3）显著的绿色化学价值：整个工艺实现了真正的“无有机溶剂”合成，获得了高产物浓度和低环境因子，是绿色生物催化的一个杰出范例。4）对DES应用的拓展：将DES的应用从“反应介质”或“单组分底物载体”推进到了“全组分底物池”的新阶段，拓展了DES在合成化学中的应用边界。
此外，研究还为进一步的探索指出了方向，例如在更高温度下进行反应以降低DES粘度、开发适用于该体系的产物分离纯化下游工艺等，这些都将推动该概念走向实际工业应用。这项研究不仅为特定高附加值萜烯酯的绿色合成提供了切实可行的方案，更重要的是为整个生物催化与绿色化学领域贡献了一个具有普遍启发意义的新策略和新思路。