该项原创性研究由德国格赖夫斯瓦尔德大学（University of Greifswald）生物化学研究所生物物理化学部的Felix Nagel、Anne Susemihl、Norman Geist等人，以及合成与结构生物化学部的Gottfried J Palm、Michael Lammers共同完成。通讯作者为Mihaela Delcea。该研究成果于2022年6月24日发表在学术期刊《Journal of Inflammation Research》上。
慢性胰腺炎（Chronic Pancreatitis, CP）是一种进行性的胰腺炎症性疾病，其病理生理机制至今尚未完全阐明。在人体内，胰蛋白酶（trypsin）的活性受到严格调控，以防止胰腺自身消化。人体主要存在两种胰蛋白酶亚型：阳离子胰蛋白酶（cationic trypsin, TRY1）和阴离子胰蛋白酶（anionic trypsin, TRY2）。在健康个体中，两者在胰腺腺泡细胞的酶原颗粒中以2:1的摩尔比存在。然而，在慢性酒精滥用、胰腺癌或慢性胰腺炎等病理条件下，由于PRSS2基因（编码TRY2）的表达被选择性上调，这一比例会发生逆转，阴离子胰蛋白酶成为主要的亚型。与因众多致病突变（如著名的R122H突变）而备受关注的阳离子胰蛋白酶不同，阴离子胰蛋白酶因其不存在致病突变且更倾向于自溶（autoproteolysis），其在胰腺炎中的角色曾被认为是有限的。但近期研究发现，在过表达TRY2的转基因小鼠中，胰腺炎病情会加剧，这明确证实了阴离子胰蛋白酶在疾病中的有害作用。由于TRY2是许多胰腺炎患者中上调的主要亚型，研究人员呼吁，针对胰腺炎设计的抑制剂应针对所有亚型进行测试，而非仅聚焦于TRY1。
然而，可能是由于PRSS2亚型固有的不稳定性，此前一直未有阴离子胰蛋白酶的晶体结构被解析。因此，本研究旨在阐明人类阴离子胰蛋白酶的分子结构，并深入了解其通过自溶进行自我调控的机制，为理解其在胰腺炎中的作用及设计新型抑制剂提供不可或缺的分子模型。
本研究首先建立了一套高效的重组表达、纯化和重折叠方法，成功获取了所有三种主要胰蛋白酶亚型（TRY1， TRY2， TRY3）及其催化失活突变体（S200A）。研究人员将编码所有胰蛋白酶亚型第16至247位氨基酸的cDNA，与N端六组氨酸标签（His6-tag）和HRV 3C酶切位点融合，克隆至表达载体。蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中以包涵体（inclusion bodies）形式过表达。包涵体经洗涤、溶解后，被缓慢滴入重折叠溶液中进行复性。复性后的蛋白通过镍离子亲和层析柱（HisTrap excel column）进行纯化，并以酶原形式储存。激活过程通过使用肠激酶（enterokinase）切除前肽完成，确认蛋白均一性的方法为分析型分子排阻色谱（Analytical Size Exclusion Chromatography）。
在酶活性鉴定方面，研究者使用发色底物L-BAPA测定了所有野生型亚型的米氏常数（Km）和转换数（kcat），并通过活性位点滴定法（active site titration）使用SPINK1抑制剂确定了活性酶浓度。结果显示，所有亚型对小分子底物的动力学特性非常相似。
本研究的核心在于解析TRYP2的晶体结构。研究人员将肠激酶激活后的TRY2浓缩至15 mg/mL，采用悬滴蒸汽扩散法在20°C条件下成功生长出晶体。晶体在液氮中冷冻保护后，于BESSY II同步辐射光源的14.2线站收集了X射线衍射数据，最终将结构解析至1.7 Å的高分辨率。结构通过以人阳离子胰蛋白酶结构（PDB: 1TRN）为搜索模型的分子置换法（molecular replacement）进行解析，并使用Phenix.refine和Coot软件进行精修和模型搭建。该晶体为等构型，每个不对称单元包含两个TRY2分子，它们形成了一个同源二聚体（homodimer）。
为了进行对比研究，科研人员还进行了分子动力学模拟（Molecular Dynamics Simulations, MD）。他们将解析出的TRY2二聚体结构突变为TRY1的序列，构建了TRY1-TRY1复合物模型。随后使用NAMD 2.14软件和CHARMm36力场，在水中对该模型进行了长达2000纳秒的平衡分子动力学模拟，以验证该二聚化模式的合理性。
1. 自溶特异性位点的确认与二聚体结构 晶体结构清晰地揭示了TRY2处于自溶过程的初始状态。SDS-PAGE分析证实，激活后的野生型TRY2在Arg122-Val123肽键处发生特异性切割，产生两条片段，但因二硫键相连而仍保持结构完整。催化失活的S200A突变体则不发生此切割。在得到的1.7 Å分辨率晶体结构中，完全没有完整的Arg122-Val123肽键的电子云密度，取而代之的是，切割后的Arg122深埋于另一个分子的S1底物结合口袋（S1 binding pocket）中，并与决定底物特异性的Asp194残基发生特异性相互作用。这一构象代表了一个此前被假设的“自抑制”（autoinhibition）状态。该二聚体的结合界面异常巨大，约800 Ų。研究表明，这种结合不仅涉及Arg122所在的环（loop），而是整个酶分子背面的大面积相互作用。一个分子以类似底物的方式结合在另一个分子的顶部，并绕Y轴旋转了约180°。在晶体学堆积中，这种二聚化模式甚至形成了无限延伸的纤维状结构，但在溶液中因亲和力弱，仅观察到二聚体的存在。
2. 自抑制与自溶的动态平衡模型 此前的生化研究表明，Arg122所在的环不仅是一个自溶位点，还具有微弱的抑制活性。本研究的结构数据证实并深化了这一机制：切割后的Arg122占据S1口袋，直接阻断了其他底物的进入，从而实现反式抑制。该机制与经典的Laskowski型丝氨酸蛋白酶抑制剂（如SPINK1）类似。然而，一个重要区别在于，Laskowski抑制剂的结合环非常刚性，而Arg122环未被其它分子内相互作用（如二硫键）所稳定。本研究中，切割后的Arg122和Val123在晶体结构中相距超过8 Å，分子动力学模拟也显示其在2000纳秒内从未接近至8 Å以内。这暗示，尽管存在肽键再连接（re-ligation）的可能，但反应平衡高度倾向于切割状态，这与其弱抑制潜能和高效自溶降解的功能是一致的。这种切割与再连接的平衡解释了SDS-PAGE上为何仍可见少量完整蛋白的条带。
3. 亚型间结构保守但表面电荷迥异 将新解析的TRY2结构与已知的TRY1和TRY3（mesotrypsin）结构进行比较，发现尽管三者的序列高度一致（>90%），且总体骨架几乎完全重叠，但其表面电荷分布差异显著，这解释了三者等电点不同的原因。TRY2是三者中负电荷最多的，其差异在酶分子的背面尤为突出。尽管S1口袋周围存在电荷差异，但口袋内部在所有亚型中均保持负电性，这与它们均偏好带正电的精氨酸或赖氨酸作为P1位残基的底物特性相符。这些结构差异为此前观察到的不同亚型对生物大分子底物或抑制剂的差异性抵抗提供了结构依据。
4. 对R122H突变致病机制的阐释 本研究结果为理解阳离子胰蛋白酶基因中R122H突变的致病性提供了直接的结构基础。R122H突变（相当于TRY2中的R122位置）消除了这个主要的自溶切割位点。本研究表明，该位点的切割不仅是酶降解清除的起始，还触发了自抑制状态。因此，R122H突变同时破坏了自溶降解和自抑制这两种关键的失效保护机制（failsafe mechanisms），导致过早激活的胰蛋白酶无法被有效清除或抑制，从而引发胰腺的自身消化和炎症。
本研究成功解析了在慢性胰腺炎和胰腺癌中占主导地位的阴离子胰蛋白酶（TRY2）的高分辨率晶体结构，首次展示了其处于自溶起始步骤的精确分子构象。研究从结构上证实了一个先前提出的自抑制模型，并详细阐明了以Arg122切割为起点的自溶失效保护机制。该发现揭示了胰蛋白酶活性调控的一个新层面：在酶原颗粒内的高浓度环境下，由自溶触发的自抑制是对抗过早胰蛋白酶激活的又一道优雅防线。
这项研究的科学价值在于，它填补了长期以来胰蛋白酶研究领域的一个关键空白，为理解阴离子胰蛋白酶的生化特性及其在胰腺炎病理中的作用提供了关键的结构框架。其应用价值在于，该结构为将来理性设计针对所有胰蛋白酶亚型的广谱或特异性抑制剂提供了精确的分子靶标，尤其是如何利用或模拟自抑制界面的巨大结合区域来开发新型药物。鉴于目前胰腺炎尚无特效药物治疗，这一结构信息为开发新的治疗策略奠定了基础。