本文属于类型a，是一篇原创研究论文。
该研究由Bart De Cat、Sin-Ya Muyldermans、Christien Coomans、Gisèle Degeest、Bernadette Vanderschueren、John Creemers、Frédéric Biemar、Bernard Peers和Guido David等人完成，主要来自比利时鲁汶大学人类遗传学系糖生物学与发育遗传学实验室、分子肿瘤学实验室，以及列日大学分子生物学与基因工程实验室。论文发表在《The Journal of Cell Biology》上，于2003年11月10日出版，具体刊载于第163卷第3期625–635页。
本研究的核心问题是糖磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican-3，简称GPC3）在内质网和高尔基体中的翻译后加工机制，以及这种加工对其在细胞存活、Wnt信号传导和斑马鱼原肠胚运动中的功能意义。GPC3功能缺失突变在人类中会导致Simpson–Golabi–Behmel综合征（简称SGBS），表现为产前和产后过度生长、内脏和骨骼异常以及胚胎性肿瘤风险增加。此前研究已表明GPC3可以抑制细胞增殖并在特定细胞类型中诱导凋亡，但其分子机制尚不清楚。已有遗传学证据提示GPC3参与Wnt和BMP等发育信号通路的调控，但蛋白质水平的加工事件如何影响这些功能仍缺乏直接证据。
本研究的第一个主要步骤是鉴定GPC3的内切蛋白水解加工事件。作者在GPC3的氨基端引入HA标签，在稳定转染的MDCK细胞中分析GPC3的成熟过程。通过非还原和还原条件下的SDS-PAGE以及肝素酶、软骨素酶处理，发现GPC3核心蛋白由两个通过二硫键相连的亚基组成：约40 kD的氨基端亚基（称为α亚基）和约30 kD的羧基端亚基（称为β亚基），其中β亚基携带硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）链和糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚。脉冲追踪实验显示，蛋白水解加工、HS取代和内切糖苷酶H抗性获得几乎同步发生，表明加工事件发生在高尔基体。布雷菲德菌素A和钙离子载体A23187均能抑制加工，提示该过程依赖钙离子和顺式高尔基体酶。此外，缺乏HS取代位点的GPC3突变体（GPC3ΔHS）仍能被正常切割，说明蛋白水解加工不依赖HS链的存在。
第二个关键步骤是鉴定GPC3的切割位点。通过序列分析，作者在GPC3的半胱氨酸富集结构域（cysteine-rich domain，CRD）内发现了一个候选的配对碱性氨基酸基序R355QYR358。定点突变实验表明，将该基序中的精氨酸和赖氨酸替换为丙氨酸（GPC3/AQYA、GPC3/RQYA或GPC3/AQYR）完全阻断了蛋白水解加工，而其他三个潜在切割位点的突变则不影响加工。共聚焦显微镜和脉冲追踪实验证实，不能被加工的GPC3/AQYA仍能正常运输到细胞膜并获得HS取代和内切糖苷酶H抗性，排除了突变引起整体运输缺陷的可能性。
第三步是确定负责GPC3加工的前蛋白转化酶（proprotein convertase，PC）成员。实验发现，α1-PDX作为一种能抑制PC家族成员的工程化抑制剂，能在CHO-K1细胞中有效抑制GPC3和GPC3ΔHS的加工。进一步利用缺乏furin的RPE.40细胞进行功能互补实验，结果显示转染furin可恢复GPC3的切割，而转染PC6A、PC6B也能部分恢复，PACE4和LPC的作用则较弱。体外实验直接证明重组furin能够切割从布雷菲德菌素A处理的细胞中纯化的未加工GPC3。这些结果表明GPC3是furin及PC家族其他成员的底物。
第四部分是研究加工对GPC3诱导凋亡能力的影响。MCF-7细胞瞬时转染实验显示，野生型GPC3和GPC3ΔHS分别导致约27%至30%的细胞出现凋亡核形态，而GPC3/AQYA仅导致约3%的凋亡率，与载体对照相当。细胞死亡ELISA也证实了这一趋势。进一步分析丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路发现，GPC3过表达导致JNK的46 kD和55 kD异构体磷酸化，但不影响ERK或p38。GPC3/AQYA过表达不能激活JNK。利用显性负性MKK4共转染实验发现，抑制JNK上游激酶可减少约42%的GPC3诱导的凋亡。这些数据建立了“前蛋白转化酶加工→JNK激活→凋亡”的线性通路，并表明HS链对该功能不是必需的。
第五部分探讨了GPC3加工对Wnt信号传导的调控作用。在CHO-K1细胞中，利用TOPFlash报告基因检测经典Wnt/β-catenin通路。结果显示，GPC3能以剂量依赖性方式抑制Wnt1诱导的报告基因活性，但GPC3/AQYA和GPC3ΔHS均无此效应。GPC3不能抑制由Dvl-1或组成型活性β-catenin诱导的报告基因活性，说明其作用位点在Dvl上游。在RPE.40细胞中，GPC3对Wnt1信号的抑制作用依赖furin的共转染，进一步证实加工是必需的。在非经典Wnt信号方面，利用AP-1响应性荧光素酶报告基因检测发现，GPC3在CHO-K1细胞中抑制Wnt5A诱导的AP-1活性，同样需要蛋白水解加工和HS链。但在MCF-7细胞中，GPC3和GPC3ΔHS却能激活AP-1并促进Wnt5A信号，而GPC3/AQYA无此效应。免疫共沉淀实验表明，Wnt5A只与经过加工的GPC3结合，且这种相互作用需要HS链，说明GPC3的蛋白核心和HS链协同参与Wnt配体的识别与调控。
第六部分通过在斑马鱼模型中的功能实验来验证体外发现的生理相关性。作者克隆了斑马鱼GPC3 cDNA，发现其具有与哺乳动物GPC3相似的结构域和保守的PC切割位点R348VSR351。在CHO-K1细胞中，野生型斑马鱼GPC3可被加工，但不携带切割位点的突变体（GPC3/AVSA）不能被切割。原位杂交显示GPC3在斑马鱼早期胚胎中广泛表达，在囊胚期和原肠胚早期几乎分布于整个动物极。利用两种反义吗啉代寡核苷酸分别阻断GPC3前mRNA剪接和翻译，结果显示GPC3敲低胚胎在10小时受精后（hpf）的原肠胚运动中发生严重缺陷，胚盘细胞向植物极的迁移停滞在60%至80%，大多数胚胎在几小时后死亡。标志基因分析显示，脊索标志基因no tail（ntl）表达域缩短和增宽，神经外胚层标志基因dlx3显示神经板中外侧增宽，近轴中胚层标志基因papc表达范围扩大，表明细胞汇聚和延伸运动受到显著影响。在拯救实验中，共注射能抵抗吗啉代作用的GPC3 mRNA可显著改善原肠胚形成和胚胎存活率，而编码不能被加工的GPC3/AVSA突变体的mRNA则不能挽救表型。这些结果直接证明，GPC3的前蛋白转化酶加工对斑马鱼原肠胚运动中的功能是必需的。
本文的核心结论是，GPC3核心蛋白在CRD结构域中经furin样前蛋白转化酶切割为通过二硫键相连的两个亚基，这一加工事件对GPC3在体外调节Wnt信号和诱导细胞凋亡以及在斑马鱼胚胎中支持原肠胚运动都是必需的。更重要的是，GPC3的蛋白核心和HS链在功能上具有分工：加工后的核心蛋白是诱导特定类型细胞凋亡的必要且充分条件，而对经典和非经典Wnt信号传导的调节还额外需要HS链的参与。作者提出了一种可能的分子模型：PC加工暴露了CRD中与Frizzled受体CRD相似的结构单元，该结构单元与HS链协同作用，像“分子镊子”一样共同捕获并调节Wnt配体的可用性。
这项研究的主要意义在于建立了GPC3翻译后蛋白水解加工与其发育功能之间的因果关系，并揭示了蛋白核心与硫酸乙酰肝素链在GPC3信号调节中的功能分工。这为理解SGBS的病理机制提供了新的分子基础，也提示GPC3的肿瘤抑制功能可能依赖于正确的蛋白水解加工。此外，本文首次将前蛋白转化酶介导的加工与Wnt信号通路的调控以及JNK介导的凋亡通路联系起来，对糖磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的功能研究具有重要的方法学和概念上的推动意义。该研究的亮点包括：首次鉴定GPC3的内切蛋白水解加工位点；证明furin及PC6是该加工的主要执行酶；通过点突变体区分蛋白核心和HS链在凋亡与Wnt信号调控中的差异功能；以及利用斑马鱼模型证明加工对体内发育功能的重要性。