基于串联融合适配体与核酶的新型哺乳动物细胞内“开”核糖开关设计

主要作者与发表信息

本研究由冲绳科学技术大学院大学（Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University）核酸化学与工程单元的Kamila Mustafina、Keisuke Fukunaga和Yohei Yokobayashi共同完成。通讯作者为Yohei Yokobayashi。该研究成果于2019年12月10日在线发表于《ACS Synthetic Biology》期刊（2020年第9卷，第19-25页）。

学术背景与研究目的

在合成生物学领域，如何在不依赖工程化蛋白质的情况下实现对哺乳动物细胞基因表达的精准化学调控，一直是研究的重点和难点。人工合成的核糖开关（synthetic riboswitches）提供了一种极具前景的解决方案。这类RNA装置通常由两部分构成：一个作为化学传感器的适配体（aptamer，即能特异性结合小分子配体的短RNA片段），以及一个将配体结合事件与基因表达相偶联的执行机制。

在哺乳动物细胞中，一种成熟的策略是在目标基因的信使RNA（mRNA）的5‘或3’非翻译区（untranslated region, UTR）中插入一个或多个变构控制的核酶，即适配体核酶（aptazymes）。一个典型的适配体核酶包含一个自切割核酶（self-cleaving ribozyme）和一个适配体，其设计原理是使核酶的自切割活性能够被结合适配体的小分子激活或抑制。当核酶在mRNA的UTR内发生切割，会导致基因表达下调（即“关”开关，off-switch）；反之，若核酶活性被抑制，则会上调编码蛋白的表达（即“开”开关，on-switch）。

尽管这种策略在调控T细胞增殖、病毒复制和基因治疗等领域展现出应用潜力，但其在哺乳动物细胞中的应用仍受到极大限制。最主要的局限在于，已报道的可用于哺乳动物细胞的适配体核酶架构（aptazyme architectures）和核酶支架（ribozyme scaffolds）种类极其有限。迄今为止，被成功应用于构建哺乳动物核糖开关的核酶仅有锤头状核酶（hammerhead ribozyme）和丁型肝炎病毒核酶（HDV ribozyme）两类。并且，几乎所有的设计都采用将适配体插入核酶茎环结构内部的策略。值得注意的是，与“关”开关相比，响应小分子激活基因表达的“开”开关（on-switch）的报道数量更少，设计也更具挑战性。

针对这一瓶颈，Yokobayashi团队前期在体外（in vitro）研究中提出了一种全新的适配体核酶架构，即串联融合架构（tandemly fused aptamer-ribozyme architecture）。该架构不再将适配体插入核酶内部，而是将两者首尾相连串联融合。此外，在适配体的上游插入了一段与核酶序列部分互补的抗核酶序列（anti-rz）。这种设计使得RNA序列可以折叠成两种互斥的二级结构：核酶结构（Rz structure）和适配体结构（Apt structure）。竞争的关键在于两个碱基茎（base stem）：一个是核酶活性所必需的P3rz茎，另一个是适配体配体结合所必需的P3apt茎。当P3apt茎过于稳定时，RNA趋向于形成适配体结构，核酶活性被抑制，基因表达为“开”；反之，则形成核酶结构，导致mRNA切割和基因表达“关”。加入配体可以稳定适配体结构，从而实现由小分子激活的“开”开关。然而，此前验证该体外架构的pistol核酶在哺乳动物细胞内无活性，导致该设计未能转变为有功能的核糖开关。

因此，本研究的首要目的是将这种创新的串联融合架构首次成功应用于哺乳动物细胞，开发出新型的“开”核糖开关。为此，研究团队选择了全新的核酶支架——twister核酶——进行尝试，这本身也是该核酶在哺乳动物细胞核糖开关中的首次应用。研究旨在通过系统性地优化和微调适配体核酶的结构，特别是P3apt茎的稳定性，来制造出高性能的鸟嘌呤（guanine）激活型“开”开关，从而拓展哺乳动物细胞基因调控的RNA工具箱。

详细研究流程与实验方法

本研究的工作流程可大致分为四个主要阶段：核酶支架功能验证、基于P3apt茎长度的初步优化、通过引入错配的精细优化，以及通过等温滴定量热法（ITC）对关键突变体进行机制验证。

第一阶段：Twister核酶在哺乳动物细胞中的功能验证与初始构建 研究团队首先需要确认所选的twister核酶（源自Nematostella vectensis的变体，文中简称为Tw）在哺乳动物细胞内的活性。他们将编码Tw核酶的序列插入到增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的3’UTR区域，构建报告质粒。将该质粒与组成型表达mCherry荧光蛋白的内参质粒共转染至人胚肾细胞（HEK293）。48小时后，通过测定细胞荧光强度评估基因表达水平。结果显示，与不含核酶的对照质粒相比，含Tw核酶的EGFP表达被抑制了96%，证明该核酶在细胞内能快速、高效地自切割。 在此成功基础上，他们将鸟嘌呤适配体的核心序列（Gua）直接融合到Tw核酶的上游，构建出基础型的适配体核酶“GuaTw”。实验表明，Gua的融合并未显著干扰核酶活性，GuaTw构建体的EGFP荧光值依然维持在低水平。

第二阶段：通过改变P3apt茎的互补碱基数进行系统优化 这是实现开关功能的第一个关键步骤。根据其串联融合架构假设，稳定P3apt茎能够通过破坏与之竞争的P3rz茎的形成来抑制核酶活性，从而提高EGFP表达。为验证此假设，他们通过增加位于上游序列（抗核酶序列）中与Tw核酶互补的碱基数量，来逐步延长P3apt茎的长度，构建了一系列从2个互补碱基（2C）到14个互补碱基（14C）的变体库。 所有变体均以第一阶段相同的报告系统在HEK293细胞中进行测试，分别在无鸟嘌呤和添加250 μM鸟嘌呤的条件下测量EGFP表达水平。 结果完全符合其机制假设：随着互补碱基数从2C增加到14C，无配体条件下的EGFP表达（即“关”水平，off level）逐步上升，并在12C时达到平台期。这表明P3apt茎的增强确实能够逐步将平衡从Rz结构推向Apt结构。在鸟嘌呤存在下，EGFP表达同样上升，但其达到平台期更早（5C）。这一差异创造了一个“调控窗口”，使得构建体4C-8C表现出了鸟嘌呤激活的“开”开关行为，其开关比率（on/off ratios，即加药与不加药条件下的表达量之比）均达到约3倍或更高。 研究团队进一步利用mfold软件分别计算了各变体在强制形成Rz或Apt两种互斥结构时的吉布斯自由能（ΔG）。分析发现，Rz结构的稳定性不受上游互补碱基数量影响，而Apt结构的稳定性随互补碱基数增加而增强。EGFP的表达水平与两种结构的能量差值（ΔGRz - ΔGApt）之间呈现出S型曲线关系，直观地解释了为何在某一特定能量窗口内能够实现配体响应的切换。

第三阶段：通过在P3apt茎内引入错配进行精细优化 为了获得更高的开关性能，研究者在上一阶段表现良好的5C、6C和7C变体基础上，进行了更精细的调控。策略是在P3apt茎的内部系统地引入单个碱基错配（mismatch），同时保持其与P3rz茎竞争的对应区域序列不变。这种设计旨在略微削弱P3apt茎的稳定性，从而将热力学平衡重新拉向Rz结构，以期在不加药时获得更低的“关”水平；而在加药后，配体的结合能仍足以稳定Apt结构，维持高水平的“开”状态。 他们为5C、6C和7C变体分别创建了一系列在P3apt茎不同位置含错配的突变体（如6C1x、6C3x、6C5x等，数字表示错配位置距适配体核心的距离）。 对这些变体的细胞荧光测试结果显示，所有引入错配的变体，其不加药时的EGFP表达水平均如预期般降低。更令人关注的是，“开”水平（加药后的表达量）与错配的位置存在显著关联：错配离适配体核心越远，“开”水平越高。最终，有四个变体的开关比率超过了6.0。其中，表现最佳的7C4x变体实现了6.7倍的开关比率。对该变体进行的剂量依赖实验显示，其半最大效应浓度（EC50）为63 μM，与先前报道的性能优异的“关”开关相当，展示了其实用潜力。

第四阶段：通过ITC实验对机制假设进行验证 为解释上述错配位置效应的分子基础，团队提出了一个假设：靠近适配体核心的错配比远离的错配对配体结合能力的损害更大，从而导致加药后无法有效稳定Apt结构，“开”水平降低。为验证该假设，他们通过体外转录合成了6C、6C1x、6C3x和6C5x四种RNA适配体变体，并利用等温滴定量热法（ITC）精确测量了它们与鸟嘌呤的解离常数（Kd）。 ITC实验结果表明，无错配的6C具有最高的亲和力。而含有错配的变体，其Kd值随着错配位置靠近适配体而急剧增大：6C1x的Kd增大了25倍，6C3x增大了6.5倍，6C5x仅增大了2.6倍。这一结果完美地印证了他们的假设，清晰地揭示了即使在结构上相距甚远的竞争茎中，局部稳定性微调对全局开关性能的深远影响。

研究结论、价值与亮点

核心结论 本研究成功开发并验证了一种全新的、用于哺乳动物细胞的“开”核糖开关设计策略。该策略基于适配体与twister核酶的串联融合架构，通过半理性地、系统性地微调一个关键竞争茎（P3apt）的稳定性，实现了基因表达的鸟嘌呤依赖性激活，最高开关比率可达6.7倍。

科学与应用价值 在科学价值层面，这项工作极大地突破了当前适配体核酶领域在核酶支架和设计架构上的双重局限。首先，它首次证明了twister核酶可以在哺乳动物细胞中用于构建功能性的核糖开关。其次，也是更重要的，它首次在活细胞中验证了“串联融合”这种全新的适配体核酶架构的可行性。该架构与经典的“内部插入”策略截然不同，为未来设计新型RNA调控装置提供了全新的思路和理论框架。研究中对茎环局部稳定性与开关整体性能之间构效关系的深刻洞察，为后续的理性设计提供了重要指导。 在应用价值层面，高性能的“开”开关是合成生物学工具箱中极为稀缺和宝贵的组件。这类开关允许通过添加无毒的小分子（如鸟嘌呤）来“开启”特定基因的表达，在基因治疗、细胞命运调控、药物筛选和生物传感等领域具有广泛的应用前景。该研究扩展了可用RNA元件的种类，为构建更复杂、更精密的哺乳动物细胞基因环路奠定了坚实基础。

研究亮点 本研究的亮点集中体现在以下三个方面： 1. 架构的独创性：核心亮点在于采用了“串联融合+竞争茎”的全新适配体核酶架构，彻底摆脱了传统“内部插入”设计的束缚，为设计“开”开关提供了新范式。 2. 元件的首创应用：首次在哺乳动物细胞核糖开关中应用了twister核酶，证明了该核酶作为基因调控元件的潜力，丰富了可用工具库。 3. 优化策略的系统性与深刻性：研究并非简单的随机筛选，而是遵循“宏观茎长调整”到“微观局部错配”的逻辑递进策略，并结合能量计算与ITC等生物物理手段对机制进行定量验证。特别是关于错配位置效应及其对配体亲和力影响的发现，揭示了“通信模块”微调的重要性，为其他RNA装置的设计提供了宝贵的、可迁移的经验。