该文档于2023年发表在期刊 *Nature Communications*，标题为“PAPγ associates with PAXT nuclear exosome to control the abundance of PROMPT ncRNAs”。主要作者包括 Xavier Contreras、David Depierre、Charbel Akkawi 等，通讯作者为 Rosemary Kiernan。研究团队来自法国国家科学研究中心（CNRS）-蒙彼利埃大学人类遗传学研究所（IGH）和图卢兹大学综合生物学中心（CBI-CNRS）等多个研究机构。
本研究的核心科学领域为核内RNA代谢与基因表达调控。人类基因组存在普遍的转录现象，产生了大量需要被加工和降解的非编码RNA，以维持细胞的正常功能。细胞核RNA外切体（nuclear RNA exosome）是细胞核内主要的RNA降解机器，但它本身缺乏底物特异性，需要通过与不同的靶向复合物（targeting complexes）结合来识别和降解特定RNA。其中，NEXT复合物主要靶向短的、非poly腺苷化的RNA，而PAXT复合物（又称PPC）则倾向于靶向poly腺苷化（polyadenylated）的RNA，其关键特征在于包含poly(A)结合蛋白PABPN1。PAXT复合物已知的底物包括启动子上游转录本（PROMPTs，又称上游反义RNA，uaRNAs），这类转录本在基因转录起始位点（TSS）上游反向转录产生，长度约500-2000个核苷酸。及时清除PROMPTs对防止其异常积累并抑制下游基因的翻译至关重要。然而，一个关键的科学问题尚未解决：PAXT底物（如PROMPTs）的长poly(A)尾巴是如何被添加的？是哪个特定的poly(A)聚合酶（PAP）负责这一过程，并直接与PAXT复合物协同工作？本研究旨在揭示PAXT复合物识别和处理其RNA底物的分子机制，特别是确定与之关联的poly(A)聚合酶，阐明其在PROMPTs代谢调控中的作用。
为了深入探究PAXT的功能，研究团队首先利用CRISPR-Cas9技术在HEK-293T细胞中构建了内源性N端标记Flag-HA（FH）的ZFC3H1细胞系（FH-ZFC3H1）。ZFC3H1是PAXT复合物的一个核心锌指蛋白亚基，可充当复合物组装的支架。研究人员通过串联亲和纯化（TAP）从细胞核提取物中纯化FH-ZFC3H1蛋白复合物，并使用银染确认其特异性条带。随后，他们通过质谱分析对纯化产物进行蛋白质组学鉴定。与对照组相比，分析识别出131个具有显著富集的互作蛋白。基因本体论分析显示，这些互作蛋白显著富集于RNA加工和剪接等通路，尤其值得注意的是“poly腺苷化”通路的显著富集。在互作蛋白列表中，不仅包含了已知的PAXT亚基，如MTR4（RNA解旋酶）和PABPN1，还确认了酿酒酵母（S. pombe）中MtREC复合物（被认为是PAXT的同源复合物）几乎所有已提出的人类直系同源物。最为关键的发现是，唯一的poly(A)聚合酶同源物是PAPγ（poly(A) polymerase gamma），而另一个主要的poly(A)聚合酶PAPα并未被检测到。这提示PAPγ可能是与PAXT特异关联的PAP。
为了验证蛋白质组学的结果，研究人员在HeLa细胞核提取物中进行了针对内源性蛋白的共免疫沉淀（co-IP）实验。实验结果证实了ZFC3H1与PAXT已知亚基（MTR4， RBM26， RBM27， PABPN1）以及新发现的互作蛋白PAPγ之间的相互作用。此外，PAPγ也被证明与RBM26， RBM27和PABPN1等PAXT亚基存在互作。研究还发现了一些与poly(A)加工相关的其他蛋白（如CPSF6， ZC3H14）以及m6A阅读蛋白（YTHDC1， YTHDC2）与PAXT亚基存在相互作用。通过RNase处理实验，他们进一步区分了不同互作对RNA的依赖性：例如，PAPγ与ZFC3H1、MTR4和RBM27的互作是RNA非依赖性的，而与PABPN1的互作则依赖于RNA的存在。这些数据共同证明PAPγ是PAXT复合物的一个内在组分，并且PAXT复合物可能通过RNA依赖和非依赖的多种相互作用网络形成。
鉴于RNA加工（包括poly腺苷化）经常与转录过程协同发生，研究团队接下来探索PAXT复合物是否在染色质上被招募。细胞分级分离实验显示，MTR4， ZFC3H1， RBM26， RBM27和PAPγ等PAXT亚基不仅存在于核浆，也部分定位在染色质上。为了在基因组水平上精确定位这些亚基的结合位点，他们对HeLa细胞进行了染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq），使用的抗体针对ZFC3H1， RBM26， PAPγ以及RNA聚合酶II（RNAPII）。分析发现，这三个PAXT亚基的信号主要富集在基因的转录起始位点（TSS）区域和增强子区域，其分布模式与RNAPII相似，在TSS处呈现尖锐的峰。热图分析进一步显示，ZFC3H1、RBM26和PAPγ的结合位点在基因组上高度重叠，特别是在一个由RNAPII信号强度排序的TSS亚群中，三者共定位现象显著。统计分析表明，ZFC3H1和RBM26的ChIP-seq峰绝大多数（>93%）都与PAPγ的峰重叠。通过再染色质免疫沉淀（re-ChIP）实验，他们进一步在单个基因座上证实了ZFC3H1和PAPγ在TSS区域的共招募。这些结果表明PAXT复合物作为一个整体被招募到活跃转录的染色质位点。
为了探究PAXT复合物在染色质上招募的调控机制，研究人员敲低了核心支架蛋白ZFC3H1（使用shRNA），并再次进行了ChIP-seq分析。Western blot证实了ZFC3H1的有效敲低，但未显著影响RBM26和PAPγ的蛋白表达水平。然而，在染色质水平上，ZFC3H1的缺失导致了其自身在TSS处结合信号的显著下降。更重要的是，RBM26和PAPγ在TSS处的结合信号也同步发生了显著减弱，并且信号丢失的程度与ZFC3H1信号的丢失高度相关。这表明ZFC3H1对于将PAXT复合物的其他核心组分（包括PAPγ）招募到染色质特定位置是必需的。
接下来，研究团队旨在阐明PAXT复合物（包括PAPγ）的染色质结合与其对PROMPTs的降解功能之间的直接联系。他们分析了已发表的ZFC3H1敲低条件下的RNA-seq数据，并将TSS根据ZFC3H1、RBM26或PAPγ在敲低后ChIP-seq信号的丢失程度进行排序。结果显示，PROMPTs的积累量在那些PAXT亚基结合丢失最严重的TSS位点也最高。为了验证PAPγ是否具有相似的功能，他们单独敲低了HeLa细胞中的PAPγ（使用siRNA）并进行了RNA-seq分析。同样地，在PAPγ敲低后，TSS相关的RNA（主要是PROMPTs）也发生了积累，且积累模式与之前根据PAXT亚基招募丢失排序的位点高度一致。重要的是，PAPγ的敲低对常规mRNA的丰度影响很小，这突显了其在非编码RNA（特别是PROMPTs）降解中的特异性作用。通过逆转录定量PCR（RT-qPCR），他们进一步在多个已知的PAXT结合基因座证实了敲低MTR4， ZFC3H1或PAPγ均会导致相应PROMPTs水平的显著上升。此外，RNA免疫沉淀（RIP）实验证明，MTR4和PAPγ的抗体能够显著富集这些PROMPTs，而ZFC3H1与MTR4存在共沉淀。这些结果将PAPγ与PAXT复合物在转录位点直接结合并调控PROMPTs丰度的功能紧密联系起来。
最后，也是最关键的一步，研究直接探究了PAPγ是否负责对PAXT靶向的PROMPTs进行poly腺苷化。他们采用了poly(A)测试（PAT）法来检测特定RNA的poly(A)尾巴长度。在分别敲低MTR4， ZFC3H1或PAPγ的HeLa细胞中提取总RNA，先用针对目标RNA内部的引物（F+R）对RNA总量进行归一化，再用针对目标RNA的引物与寡聚dT引物（F+T）来扩增带有poly(A)尾巴的片段，后者在凝胶上呈现为弥散的条带（“拖尾”）。实验结果显示，敲低MTR4， ZFC3H1或PAPγ均显著降低了多个PROMPTs的poly(A)尾巴信号强度，而一个对照mRNA（K-RAS）的poly(A)尾巴信号则受到轻微且不同的影响。使用RNase H处理以特异性降解RNA-DNA杂交链后，F+T产生的弥散条带消失，证实了检测信号确实来源于poly(A)尾巴。这些数据提供了直接证据，表明与PAXT复合物相关联的PAPγ对于PROMPTs的有效poly腺苷化是必不可少的。
本研究的主要结论是：细胞核特异性poly(A)聚合酶PAPγ是PAXT核内外切体靶向复合物的一个功能性组分。PAXT复合物，包括PAPγ，被核心支架蛋白ZFC3H1招募到数百个基因的转录起始位点。在该位点，PAPγ负责对新生产生的PROMPT非编码RNA进行poly腺苷化。poly(A)尾巴的存在可能通过PABPN1促进PAXT复合物的进一步结合，并最终引导核内外切体对PROMPTs进行降解。ZFC3H1或PAPγ的缺失会破坏这一过程，导致PROMPTs因poly腺苷化不足和降解受阻而积累。
本研究具有重要的科学意义和应用价值。在科学价值方面：它首次在哺乳动物细胞中建立了从特定poly(A)聚合酶（PAPγ）到RNA外切体靶向复合物（PAXT）再到其底物（PROMPTs）降解的完整分子通路，解决了该领域长期存在的一个关键问题——PAXT底物的poly(A)尾巴来源。研究揭示了RNA降解机器的靶向可以发生在转录的初始阶段，即“共转录性”降解，拓展了我们对核内RNA质量监控和基因表达调控时空维度的理解。通过将PAPγ的功能与PAXT复合物特异性关联，也部分解释了PAPγ和PAPα这两个同源酶在细胞功能上的可能分工。在应用价值方面：PROMPTs等非编码RNA的异常积累与细胞功能紊乱和疾病相关，例如已有研究表明其可抑制蛋白质翻译。因此，阐明其精确的降解机制为未来干预相关病理过程提供了潜在的理论靶点。此外，本研究整合了CRISPR基因编辑、蛋白质组学、ChIP-seq、RNA-seq、多种互作验证和功能性生化实验（PAT）等多重技术手段，为研究大型核糖核蛋白复合物的组成、定位和功能提供了一个完整且严谨的方法学范例。
本研究的亮点突出体现在以下几个方面：首先，关键发现具有高度新颖性：首次鉴定出PAPγ是PAXT复合物的专属poly(A)聚合酶，并直接证明了其在PROMPTs poly腺苷化中的必需作用，填补了知识空白。其次，研究视角独特：创新性地通过ChIP-seq技术描绘了RNA降解机器组分在染色质上的全基因组结合图谱，强有力地证明了PAXT对底物的靶向发生在转录起始位点，为“共转录性RNA降解”提供了直接证据。第三，逻辑链条完整严谨：从复合物组分鉴定（蛋白质组学）、互作验证（co-IP）、基因组定位（ChIP-seq）、功能缺失表型分析（RNA-seq， RT-qPCR）、底物直接结合证明（RIP）到最终生化功能确认（PAT assay），构建了一个从“是什么”到“在哪里”再到“如何工作”的完整证据链。第四，良好的进化保守性关联：研究通过与裂殖酵母S. pombe中的同源复合物MtREC进行对比，将PAPγ定位为MtREC中Pla1聚合酶的人类直系同源物，增强了发现的生物学普遍性意义。最后，研究还暗示了更广泛的调控网络，例如发现了PAXT与m6A阅读蛋白及3‘端加工因子CPSF6的潜在联系，为未来探索转录后修饰与核RNA降解之间的交叉调控开辟了新方向。
这项研究不仅解答了一个具体的分子生物学问题，更重要的是深化了我们对细胞如何精密调控其转录组、及时清除潜在有害的非编码RNA以维持自身稳态的理解，是核内RNA代谢领域的一项重要进展。