本文于2016年发表在学术期刊 Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 上，由来自华中农业大学水产学院、农业部淡水动物繁育重点实验室以及湖北省淡水水产协同创新中心的研究团队完成，主要作者包括蔡文静、梁旭方（通讯作者）、袁小岑、李爱旋、何雨慧和何珊。

本研究属于比较生理学与分子生物学领域，重点关注鱼类内分泌与代谢调控。胰岛素作为一种关键的肽类激素，在调节脊椎动物的生长、发育和能量代谢（特别是碳水化合物代谢）中发挥核心作用。其生物学效应通过靶细胞表面的胰岛素受体介导。在哺乳动物中，胰岛素受体存在两种亚型（胰岛素受体亚型A和B，即InsRA和InsRB），它们由同一基因通过选择性剪接产生，在组织分布和功能上存在差异。然而，在硬骨鱼类中，相关研究相对匮乏且不完整。此前研究表明，胰岛素受体参与鱼类的胚胎发育、摄食调节和葡萄糖代谢，但其具体亚型的分子特征、组织分布及在葡萄糖稳态中的特异性作用尚不清楚。草鱼作为中国重要的淡水养殖物种，对葡萄糖的利用能力较高，是研究鱼类胰岛素信号通路的良好模型。因此，本研究旨在：（1）克隆并解析草鱼两种胰岛素受体基因（InsRA和InsRB）的完整编码序列和基因组结构；（2）比较分析它们与其他脊椎动物同源蛋白的序列、结构、系统发生关系和基因共线性；（3）检测这两种受体在草鱼不同组织中的表达分布；（4）探究在高碳水化合物饮食条件下，两种受体在肝脏中的表达变化及其与血糖、胰岛素水平的关系，从而揭示它们在血糖调节中可能扮演的不同角色。本研究的目标是为深入理解鱼类胰岛素信号系统的进化、结构特征及其生理功能奠定分子基础。

详细研究流程如下：

本研究包含四个主要步骤，依次为：基因克隆与序列分析、基因组结构与共线性分析、组织表达谱分析以及饮食干预实验。

1. 基因克隆与序列分析： * 研究对象与来源： 研究材料为草鱼。用于基因克隆的组织样本来自经驯养的草鱼个体。 * 实验流程： 首先，研究者基于实验室已有的草鱼转录组测序数据，通过SOAP aligner/soap2软件比对到草鱼基因组（数据来源于中国科学院水生生物研究所），初步获得了草鱼InsRA和InsRB的编码序列（CDS）及其基因组结构信息（内含子/外显子区域）。为了验证序列准确性，他们设计特异性引物，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目标片段。PCR产物经纯化后，克隆至pEASY-T1载体，转化至DH5α感受态细胞，挑选至少6个阳性克隆进行双向测序验证。获得确证序列后，使用EditSeq等生物信息学软件将核苷酸序列翻译为氨基酸序列。通过ClustalW2进行多序列比对，分析草鱼InsRA和InsRB与其他鱼类及哺乳动物（如人）胰岛素受体的氨基酸序列同源性。使用MEGA 6.0软件，基于邻接法（Neighbor-Joining method）构建系统进化树，并进行1000次自举检验评估分支置信度。此外，利用在线工具SMART预测蛋白质结构域。

2. 基因组结构与共线性分析： * 分析方法： 基于已获得的草鱼胰岛素受体基因组序列，分析其外显子-内含子结构。同时，为了探究胰岛素受体基因在进化过程中的保守性，研究者进行了共线性分析。 * 数据来源与工具： 他们利用Ensembl基因组浏览器和NCBI的Map Viewer，查询并比较了人类、牛、狗、鸡、非洲爪蟾、尼罗罗非鱼和斑马鱼等多个脊椎动物物种中，胰岛素受体基因及其侧翼基因的排列顺序。重点分析了草鱼InsRA和InsRB基因座上下游的基因组成。

3. 组织表达谱分析： * 研究对象与样本量： 从6尾草鱼个体中采集了9种组织样本，包括脑、心脏、前肠、中肠、后肠、肝脏、肌肉（背肌）、脂肪（肠系膜脂肪）和肾脏。所有样本迅速用液氮冷冻，于-80°C保存直至RNA提取。 * 实验流程： 使用TRIzol试剂从各组织中提取总RNA，检测其纯度和完整性。取1微克总RNA进行逆转录，合成cDNA。随后，针对InsRA和InsRB设计特异性引物（见表2），以β-肌动蛋白（β-actin）基因作为内参，利用实时定量PCR（RT-qPCR）技术检测各组织中两种受体mRNA的表达水平。每个RNA样本设置三个技术重复。反应体系使用Bio-Rad的Gotaq® qPCR Mastermix，在MyiQ™2双色实时PCR检测系统上运行。基因相对表达量采用2^-ΔΔCt方法计算。通过熔解曲线和测序验证引物特异性，并确认各基因引物的扩增效率相近（β-actin: 100.3%, InsRA: 96.3%, InsRB: 99.5%），满足比较Ct值法的前提条件。

4. 饮食干预实验： * 实验设计与对象： 研究设计了两种等氮但碳水化合物水平不同的实验饲料：对照组（25 g/kg碳水化合物）和高碳水化合物组（HC，42 g/kg碳水化合物）。饲料以酪蛋白和明胶为蛋白源，玉米淀粉为碳水化合物源，鱼油和豆油为脂肪源。实验鱼在1000升水槽中驯养2周后，随机分为两组，每组设3个重复水槽，每个水槽放养15尾鱼（初始平均体重200.7 ± 1.6 g）。实验持续6周，每天饱食投喂两次。 * 样本采集与处理： 实验结束后禁食约24小时，从每个水槽随机取3尾鱼，麻醉后采集血液和肝脏样本。血液离心分离血清，用于测定血糖浓度（使用Abbott Aeroset全自动生化分析仪）。部分肝脏样本用于测定胰岛素浓度（使用鱼胰岛素ELISA试剂盒）。另一部分肝脏样本迅速冻存于液氮，用于后续RNA提取和基因表达分析（方法同组织表达谱分析，即RT-qPCR检测肝脏中InsRA和InsRB的表达）。 * 数据分析： 所有数据使用SPSS 19.0软件进行统计分析。首先进行正态性检验（Shapiro-Wilk test）和方差齐性检验。组间差异采用单因素方差分析（One-way ANOVA），若方差齐则用Duncan多重比较检验进行事后分析。显著性水平设定为P < 0.05。数据以平均值±标准误表示。

主要研究结果如下：

1. 序列与蛋白质结构分析结果： * 成功获得了草鱼InsRA和InsRB的完整CDS。InsRA CDS长4068 bp，编码1355个氨基酸的蛋白质；InsRB CDS长4056 bp（位于4514 bp的转录本中），编码1351个氨基酸的蛋白质。序列已提交GenBank（登录号：KP713801和KR866114）。 * 多序列比对显示，草鱼InsRA与斑马鱼InsRA的氨基酸一致性最高（96.60%），与其他鱼类相似性超过80%，与人类胰岛素受体的一致性为69.69%。草鱼InsRB与斑马鱼InsRB的一致性为85.30%，与其他鱼类约为70%。系统进化分析证实，硬骨鱼类的胰岛素受体明显分为两个独立的进化簇（分别对应InsRA和InsRB），而两栖类、鸟类和哺乳类的胰岛素受体聚集在另一簇。草鱼InsRA和InsRB分别位于两个不同的鱼类受体簇中，且与斑马鱼相应受体亲缘关系最近。 * 蛋白质结构预测表明，草鱼InsRA和InsRB具有保守的胰岛素受体结构特征。两者均含有一个四碱性氨基酸蛋白酶切位点（InsRA: RQRR 733-736；InsRB: RRRR 733-736），可将前体蛋白切割为α亚基和β亚基。α亚基完全位于胞外，包含信号肽（InsRA 19 aa, InsRB 25 aa）、两个纤连蛋白III型结构域（FNIII）的一部分。β亚基包含跨膜区、剩余的FNIII结构域以及胞内的酪氨酸激酶结构域（TyrKc）。在酪氨酸激酶结构域内，存在潜在的ATP结合位点和自磷酸化位点。这些关键功能域在脊椎动物中高度保守。

2. 基因组结构与共线性分析结果： * 草鱼InsRA和InsRB基因均包含21个外显子和20个内含子，总长度分别为64.686 kb和71.863 kb。其外显子长度与斑马鱼相应基因高度相似。 * 共线性分析揭示了鱼类与哺乳类胰岛素受体基因座的显著差异。在鱼类（草鱼、斑马鱼、罗非鱼）中，InsRA和InsRB位于不同的染色体位置，且各自侧翼的基因组成在鱼类内部高度保守。例如，草鱼InsRA邻近基因包括DAPK3、SPPL2、ARHGEF18等；InsRB邻近基因包括USE1、ARHGEF18b、ENC1等，这种排列与斑马鱼完全一致。ARHGEF18基因在几乎所有分析物种中都与胰岛素受体基因相邻（非洲爪蟾除外），提示两者可能存在功能关联。然而，在哺乳动物（人、牛、狗）中，胰岛素受体基因侧翼高度保守的基因是ARHGEF18、PEX11G和C19orf45。重要的是，在鱼类、哺乳类、鸟类和两栖类之间，未发现保守的基因共线性关系。

3. 组织表达谱结果： * InsRA和InsRB在草鱼所有检测组织中均有表达，但分布模式存在重叠又有区别，呈现组织特异性。 * InsRA mRNA在后肠和心脏中表达水平最高，其次在肝脏中也有较高表达。 * InsRB mRNA在肝脏和后肠中表达水平最高。 * 两种受体在脑组织中表达量均较低。

4. 饮食干预实验结果： * 与对照组相比，饲喂高碳水化合物饲料（HC）的草鱼，其血清葡萄糖水平和肝脏胰岛素浓度均显著升高（P < 0.05）。 * 在高碳水化合物组草鱼的肝脏中，InsRB基因的相对表达量显著高于对照组（P < 0.05）。 * 然而，肝脏中InsRA基因的表达量在高碳水化合物组和对照组之间没有显著差异。

研究结论、意义与亮点如下：

结论： 本研究首次完整克隆并鉴定了草鱼两种胰岛素受体基因（InsRA和InsRB）。它们在氨基酸序列、蛋白质结构域组成上与其他脊椎动物高度保守，提示胰岛素信号结合与下游激活的基本模式在脊椎动物中是相似的。两种受体在组织中广泛但差异性的表达，可能与其在消化、代谢和能量储存等不同生理过程中的特异性功能相关。更重要的是，饮食实验证明，草鱼胰岛素受体参与了血糖稳态的调节，并且InsRA和InsRB可能发挥不同的作用：InsRB对高碳水化合物饮食引起的血糖和胰岛素变化反应更为敏感，其表达在肝脏中显著上调，而InsRA的表达则未发生显著变化。系统发生和共线性分析强有力地证实，鱼类InsRA和InsRB源自两个独立的基因，这与哺乳动物由单一基因通过选择性剪接产生两种亚型的机制截然不同。鱼类与哺乳类胰岛素受体基因在生成机制和基因组共线性上的巨大差异，可能是导致两者在胰岛素信号生理功能（特别是葡萄糖代谢利用特性）上存在种间差异的重要原因之一。

科学价值与应用价值： * 科学价值： 本研究丰富了鱼类内分泌学，特别是胰岛素信号通路的基础数据。它清晰地揭示了鱼类胰岛素受体系统的独特性（双基因起源），为研究脊椎动物胰岛素受体家族的进化提供了关键证据。研究结果将“基因结构/进化差异”与“生理功能差异”联系起来，为理解鱼类为何普遍存在葡萄糖耐受性较差（即对高糖饮食处理能力较弱）这一生理现象提供了新的分子进化视角。同时，关于InsRA和InsRB可能具有不同生理功能的发现，为后续深入研究鱼类碳水化合物代谢的精细调控机制指明了方向。 * 应用价值： 草鱼是中国最重要的养殖鱼类之一。了解其胰岛素信号通路及葡萄糖代谢调控机制，对于研发更符合草鱼营养需求的环保型饲料（例如优化碳水化合物来源和水平）、提高饲料利用效率、改善养殖鱼类健康和生产性能具有潜在指导意义。

研究亮点： 1. 完整性： 首次报道了草鱼两种胰岛素受体基因的完整编码序列、基因组结构及详细的蛋白质结构域分析。 2. 系统性比较： 从序列、结构、系统发生、基因共线性、组织表达到生理功能响应，对InsRA和InsRB进行了多层次、系统的比较分析。 3. 关键发现： 明确了鱼类胰岛素受体“双基因起源”的进化特征，并通过共线性分析提供了坚实证据。 4. 功能关联： 通过可控的饮食实验，将分子表达变化与生理指标（血糖、胰岛素）相关联，初步揭示了InsRB在响应膳食碳水化合物变化中可能扮演更直接的角色，为两种受体功能分化提供了实验线索。 5. 模型重要性： 研究聚焦于具有重要经济价值和独特食性（草食性）的草鱼，其研究成果对理解鱼类，尤其是草食性鱼类的营养代谢具有代表性意义。

其他有价值内容： 研究指出，ARHGEF18（一种Rho GTP酶鸟嘌呤核苷酸交换因子）基因在几乎所有分析的脊椎动物中都紧邻胰岛素受体基因，鉴于GEF蛋白在调控细胞骨架重排、基因转录、细胞生长和运动等多方面功能，作者推测ARHGEF18可能与胰岛素受体存在紧密的功能互动，这是一个有趣的观察，可能值得在未来研究中深入探讨。此外，研究补充数据（在线可查）提供了详细的氨基酸序列比对表、系统进化树等信息，增强了研究的可靠性和深度。