Philip Newsholme*、Rui Curi*、Siamon Gordon† 与 Eric A. Newsholme*合作完成的研究《小鼠巨噬细胞对葡萄糖、谷氨酰胺、长链脂肪酸及酮体的代谢》于1986年发表在《Biochem. J.》（第239卷，第121-125页）。*表示作者隶属于牛津大学生物化学系，†表示作者隶属于牛津大学Sir William Dunn病理学院。这项研究系统地探究了炎症状态下小鼠腹腔巨噬细胞的代谢特征，旨在填补对巨噬细胞中间代谢认知的空白，并与大鼠淋巴细胞进行比较，以揭示这些免疫细胞在能量和物质代谢上的异同。
研究的学术背景植根于免疫细胞生物学与代谢生物学的交叉领域。淋巴细胞与巨噬细胞在免疫反应中扮演核心角色，但当时对于它们如何利用不同燃料产生能量和执行功能的“中间代谢”过程知之甚少。尽管对巨噬细胞的呼吸爆发等特定代谢方面有所研究，但关于其基础燃料选择和整体代谢通路能力的系统了解仍很匮乏。与此同时，同一团队先前的研究已经揭示了淋巴细胞具有独特的代谢特征，例如高活性的谷氨酰胺酶和特定的酶谱模式。这促使研究者们思考：同样在免疫系统中至关重要的巨噬细胞，其代谢策略是否与淋巴细胞相似，还是存在根本性差异？此外，学界通常隐含地认为葡萄糖是吞噬细胞的主要乃至唯一燃料，但这一观点缺乏全面的酶学证据支持。因此，本研究的目标是：1) 系统地测定小鼠巨噬细胞中参与葡萄糖、谷氨酰胺、酮体和脂肪酸代谢的关键酶的最大活性，以评估其代谢潜力；2) 测量离体培养的“静息”巨噬细胞对这些燃料的实际利用率；3) 将这些结果与已发表的大鼠淋巴细胞数据进行直接比较，从而阐明两种重要免疫细胞的代谢差异，并推测这些差异如何支持其各自独特的功能状态（如巨噬细胞的高度分泌和吞噬活性）。
研究的工作流程包含五个清晰连贯的步骤，分别是：研究对象获取与制备、酶活性测定、燃料利用率测定、数据分析与比较、以及最终的结论推导。详细步骤如下：
首先，研究对象的制备分为细胞获取和均质化两个环节。巨噬细胞来自12-16周龄的C57BL/6雌性小鼠，通过腹腔注射硫代乙醇酸盐肉汤诱导炎症反应，4天后从腹腔收集细胞。这些细胞在含有10%胎牛血清的培养基中贴壁培养4小时，洗去非贴壁细胞（主要是淋巴细胞），从而获得高度富集（>95%纯度）且稳定的巨噬细胞群体，每皿蛋白含量为2-4毫克。淋巴细胞则作为比较对象，取自Wistar雄性大鼠的肠系膜淋巴结，采用该团队先前已建立的方法进行纯化。在酶活性测定前，需要对细胞进行破碎处理。巨噬细胞用小型玻璃匀浆器在0°C条件下用提取介质匀浆。对于大多数酶，直接使用全匀浆液进行测定。少数酶需要特殊处理：糖原磷酸化酶需离心取上清；酮体利用酶（3-氧代酸CoA转移酶和3-羟基丁酸脱氢酶）的匀浆液需要超声处理并离心；而用于测定线粒体酶（如α-酮戊二酸脱氢酶和肉碱棕榈酰转移酶）的样品，则需通过差速离心分离得到线粒体组分。淋巴细胞的匀浆采用Polytron匀浆器，其线粒体提取流程与巨噬细胞类似。
其次，酶活性测定的核心是使用分光光度法测定单位时间内底物的消耗量。研究测定了超过20种关键酶的活性。酶学实验在25°C（谷氨酰胺酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶在37°C）下进行，使用Gilford分光光度计监测特定波长（340 nm、412 nm或303 nm）吸光度的变化速率，从而计算出酶活性。为保证测定的是最大活性，研究团队进行了预实验，并借鉴了前期工作（如Crabtree等人，1979）的方法，例如在多数酶测定体系中加入Triton X-100以确保酶完全释放。所有酶活性最终以“纳摩尔底物消耗/分钟/毫克蛋白”表示。蛋白定量采用Bradford法，值得注意的是，这与此前该团队研究中常用的Lowry法不同，作者指出这可能导致淋巴细胞酶活性的绝对值与早期报告存在微小差异。
第三，燃料利用率的测定模拟了细胞在接近生理条件下的代谢状态。将贴壁培养的巨噬细胞在特定缓冲体系中孵育60分钟，培养基中分别添加特定浓度的底物：5 mM葡萄糖、2 mM谷氨酰胺、0.5 mM油酸（放射性标记以追踪其氧化）、3 mM乙酰乙酸、3 mM β-羟基丁酸。通过测定孵育前后培养基中底物（如谷氨酰胺）的消耗量，或者收集和测量放射性底物（如[14C]油酸）氧化生成的14CO2，计算出这些燃料的“静息”利用率，同样以“纳摩尔底物消耗或氧化/小时/毫克蛋白”表示。
第四，数据分析与比较是整个研究的逻辑核心。研究将测得的巨噬细胞酶活性数据和燃料利用率数据，与大鼠淋巴细胞的对应数据（部分引用自该团队之前的发表）进行并列对比。这种横向比较旨在揭示细胞类型间的定量差异。此外，研究还运用了比较酶学原理，即：将同一细胞内的不同酶活性进行比较，以推断代谢通路的相对重要性；将酶的最大活性与离体条件下的实际燃料利用率进行比较，以评估代谢通路在静息状态下的利用程度及其潜在的上调空间。
研究的主要结果内容丰富，数据详实，逐步揭示了巨噬细胞独特的代谢图谱： 1. 糖酵解与磷酸戊糖途径：酶活性数据显示，巨噬细胞的己糖激酶活性高达76 nmol/min/mg蛋白，是淋巴细胞的4倍以上，甚至被指出与体内任何主要组织的活性相当。该活性显著高于糖原磷酸化酶（3.0）和6-磷酸果糖激酶（22.8），表明葡萄糖是比糖原更重要的燃料，且磷酸戊糖途径可能占重要地位。后一点得到了高活性的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（34.5）和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（23.8）的支持。然而，“静息”巨噬细胞对葡萄糖的利用率（339 nmol/h/mg）仅占6-磷酸果糖激酶最大活性的不到10%，这强烈暗示在吞噬或高分泌活动时，糖酵解速率可能被剧烈上调。 2. 三羧酸循环：巨噬细胞的柠檬酸合酶活性（108）和α-酮戊二酸脱氢酶活性（10.1）均显著高于淋巴细胞，提示三羧酸循环在巨噬细胞产能中扮演重要角色。特别是α-酮戊二酸脱氢酶的活性被用作衡量有氧代谢能力的指标，其数值表明巨噬细胞的氧化代谢潜力相当可观。 3. 酮体和脂肪酸代谢：巨噬细胞的3-氧代酸CoA转移酶活性（36.6）高于淋巴细胞，但3-羟基丁酸脱氢酶活性（0.17）极低，表明其利用乙酰乙酸的能力强于β-羟基丁酸。但实际孵育实验中，3 mM的两种酮体均未被检测到明显的利用。肉碱棕榈酰转移酶的活性在巨噬细胞（0.75）中高于淋巴细胞，暗示脂肪酸氧化潜力更大。对应的，巨噬细胞对油酸的氧化速率约为1.0 nmol/h/mg，虽然绝对值低，但作者指出这仅为肉碱棕榈酰转移酶最大活性的2.2%，意味着在能量需求增高时，脂肪酸的氧化速率有上调空间。 4. 谷氨酰胺代谢：这是最显著的差异之一。巨噬细胞的磷酸盐依赖性谷氨酰胺酶活性高达152 nmol/min/mg蛋白，是淋巴细胞（39.4）的约4倍，表明其分解谷氨酰胺的潜力巨大。其他相关酶如谷氨酸脱氢酶（98.6）和天冬氨酸氨基转移酶（118）的活性也很高，而丙氨酸氨基转移酶活性很低，NADP+依赖性苹果酸脱氢酶活性几乎检测不到。这些酶谱特征与淋巴细胞类似，但又不完全相同（如NADP+依赖性苹果酸脱氢酶的差异），提示巨噬细胞中存在一条以谷氨酰胺酶为起点，通过转氨基作用和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶等将碳骨架送入三羧酸循环或糖异生前体池的通路。然而，“静息”巨噬细胞对谷氨酰胺的实际利用率（102 nmol/h/mg）远低于谷氨酰胺酶的最大活性（约1/90），与报道的大鼠淋巴细胞速率相似。这说明谷氨酰胺通路在基础状态下也未被充分利用，其转运或线粒体摄取步骤可能是限速环节，或者其活性也像糖酵解一样，在功能激活时能被大幅诱导。
这些结果逻辑紧密地导向了研究的结论。研究揭示了小鼠巨噬细胞具有独特的、高容量的代谢酶谱：1）高活性的己糖激酶和磷酸戊糖途径酶，暗示葡萄糖不仅是重要燃料，其分解还能为生物合成（如通过磷酸戊糖途径产生NADPH）提供支持。2）活跃的三羧酸循环酶表明其强大的有氧氧化能力，挑战了葡萄糖是吞噬细胞唯一重要燃料的旧观点。3）极高的谷氨酰胺酶活性提示谷氨酰胺代谢潜能巨大，尽管静息利用率不高，但其通路可能与支持高蛋白质/RNA周转率所需的嘌呤、嘧啶合成前体供应有关。4）有限的酮体利用能力和中等的脂肪酸氧化酶活性，表明长链脂肪酸和乙酰乙酸在特定条件下可作为三羧酸循环的乙酰-CoA来源。巨噬细胞的代谢设计符合其作为终末分化、不增殖但具有高分泌、高吞噬活性和高质膜周转的细胞特性，其多条代谢通路均具备在功能激活时被迅速上调的潜力。
本研究的价值与亮点在于：科学价值：首次系统描绘了炎症性巨噬细胞的中间代谢酶谱和基础燃料利用率，为理解巨噬细胞生物学提供了关键的代谢维度。通过与淋巴细胞对比，强调了不同免疫细胞亚群可能采用不同的代谢策略来适应其功能需求。应用价值：为未来研究巨噬细胞在感染、炎症、肿瘤等病理状态下代谢重编程奠定了基础。高谷氨酰胺酶活性的发现，提示靶向谷氨酰胺代谢可能成为调控巨噬细胞功能的潜在途径。重要观点：明确指出巨噬细胞并非单一依赖葡萄糖，其氧化代谢（三羧酸循环）非常重要，且存在利用多种燃料（葡萄糖、谷氨酰胺、脂肪酸）的代谢灵活性。酶的最大活性与实际利用率的差距，为“代谢储备”或“代谢可塑性”概念提供了有力证据，预示了在激活状态下代谢通量的巨大变化空间。研究亮点：1) 方法的系统性：结合了最大酶活性测定（评估代谢潜力）和离体燃料利用测定（评估静息代谢状态），提供了更全面的图景。2) 比较研究的视角：始终以淋巴细胞为参照，使巨噬细胞的代谢特征在对比中更为鲜明和有意义。3) 样本制备的可靠性：使用硫代乙醇酸盐诱导的巨噬细胞，获得了均一、稳定的细胞群体，保证了数据的可重复性。4) 对经典观点的挑战：用数据质疑了“葡萄糖是吞噬细胞唯一重要能源”的普遍看法，提出了多燃料氧化的可能性。
此外，文中还包含一些有价值的讨论，例如指出高糖酵解速率可能为生物合成过程提供最佳敏感性的微环境；对脂肪酸氧化的讨论中，排除了高肉碱棕榈酰转移酶活性主要服务于膜磷脂周转的可能性；以及对谷氨酰胺代谢通路细节的推测，均体现了研究的深度和思考的广度。