学术研究报告：ROTIS——一种无需组织培养的大豆遗传转化新系统

第一作者及单位
本研究由东北农业大学的Yongguang Li、Ke Lu等团队主导，合作单位包括中国农业科学院作物科学研究所和国家南繁研究院。研究成果于2025年12月4日以“Letter”形式发表于《Plant Physiology》（2025年第199卷，DOI: 10.1093/plphys/kiaf609）。

学术背景
大豆遗传转化是作物改良、功能基因组学和分子育种的核心技术，但传统方法受限于基因型依赖性、技术复杂性和严格的无菌要求（Xu et al. 2022）。尽管已有改进的载体（如Paz et al. 2006开发的载体）和农杆菌介导的优化方案（Arun et al. 2015），但基因型屏障仍是主要挑战（Cao et al. 2023）。为此，本研究开发了“Ruby辅助的一步式无组织培养大豆体内转化系统”（ROTIS），旨在简化流程、缩短周期（40-80天），并实现多基因型兼容。

研究流程与方法
1. 实验设计与材料
- 研究对象：21个遗传多样性大豆品种，包括东北主栽品种（如东农50、垦丰16）和不同生态型品种（如黑农531、蒙豆1137）。
- 核心工具：Ruby报告基因（由CaMV 35S启动子驱动）和GUS-NPTII融合基因（用于双重筛选）。

1. 转化流程

   • 幼苗处理：大豆种子在25℃黑暗条件下于珍珠岩盒中萌发，浇灌含0.1 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）的溶液。子叶展开后，切除顶端分生组织，暴露生长点（图1a1-a3）。
     
   • 农杆菌侵染：将外植体浸入含农杆菌EHA105（OD600=1.0-1.2）的共培养培养基（CCM），真空渗透（-0.08 MPa, 30秒），后用农杆菌浸润棉球覆盖伤口（图1a4-a6）。
     
   • 共培养与筛选：22℃弱光下共培养48小时，随后每48小时更换含卡那霉素（50 mg/L）的棉球。3-8天后，转入含100 mg/L卡那霉素的培养基筛选非转化细胞（图1a7-a9）。
     
   • 不定芽诱导与验证：14-21天后，通过Ruby红色表型（图1c1-c5）和GUS组织化学染色（图1j-m）筛选阳性苗，经PCR（图1i）和RT-qPCR（图1n-o）验证转基因稳定性。
     

2. 数据分析

   • 统计转化效率（28.6%-64.3%）、Ruby阳性芽比例（最高35.7%），并与传统方法对比（如东农50转化效率从6.42%提升至ROTIS的高效水平）。
     

主要结果
1. 高效转化与基因型普适性
- ROTIS在21个品种中均成功获得转基因植株，包括传统难转化的商业品种（如黑农531）。Ruby红色表型与农杆菌侵染效率呈正相关（附表S1）。
- 与传统方法相比，ROTIS周期缩短至40-80天，且单外植体可产生多个独立转化事件（图1c2-c5）。

1. Ruby标记系统的优势

   • Ruby基因的红色表型可早期可视化筛选（图1c1），减少抗生素筛选的耗时和成本。
     
   • 转基因植株的Ruby表达呈现时空特异性：叶片叶脉红色（图1d1-d2）、白花品种花瓣变粉（图1e1-e3），种子种皮红褐色（图1f5-f6）。
     

2. 分子验证与遗传稳定性

   • T1代符合孟德尔3:1分离比（附图S1），T4代未发现基因沉默。RT-qPCR显示Ruby与GUS转录水平同步（图1n-o），但红色强度受宿主代谢调控（He et al. 2020）。
     

结论与价值
1. 科学意义
- ROTIS突破了传统组织培养的基因型限制，为大豆功能基因组学研究提供了高通量平台。
- Ruby-GUS双标记系统实现了转化过程的实时监控，为其他作物的转化技术优化提供参考。

1. 应用前景
   
   • 可扩展至其他抗性基因（如草铵膦抗性基因bar），助力分子育种。
     
   • 简化流程降低技术门槛，适合推广至资源有限的实验室。
     

研究亮点
1. 方法创新：首次将Ruby报告基因与无组织培养体系结合，实现“一步式”转化。
2. 普适性突破：在21个品种中验证有效性，涵盖不同生态型和农艺性状（如花期、百粒重）。
3. 效率提升：周期缩短50%以上，且单外植体多事件转化提高产出率。

其他发现
- 部分转化株出现嵌合体（图1e2），需通过节点筛选进一步纯化。
- 国家自然科学基金（U22A20473）等项目的资助为技术优化提供了关键支持。

（注：文中涉及的术语如“农杆菌介导转化（Agrobacterium-mediated transformation）”“共培养培养基（CCM）”等均为首次出现时标注英文原词。）