本研究由魏晓世（Xiaoshi Wei）、吴昊（Hao Wu）、王子翔（Zixiang Wang）等完成，其中魏晓世、吴昊、王子翔为并列第一作者，通讯作者为王翀（Chong Wang），所属单位为浙江农林大学动物科技学院·动物医学院（College of Animal Science and Technology & College of Veterinary Medicine, Zhejiang A&F University）。合作单位包括浙江大学动物科学学院（College of Animal Science, Zhejiang University）和建明（中国）科技有限公司（Kemin (China) Technologies Co. Ltd.）。该研究发表于学术期刊《Animal Nutrition》2023年第15卷，页码320至331，于2023年8月16日在线发表。
乳蛋白是评价牛奶品质的重要指标，也是易于人体吸收的优质蛋白。长期以来，提高日粮粗蛋白（crude protein, CP）浓度被认为是提升乳蛋白的有效手段。然而，随着奶牛养殖规模扩大，蛋白饲料价格持续上涨，如何提高蛋白利用效率成为奶业经营的核心问题。高CP日粮虽能满足高产奶牛营养需求，但在氨基酸（amino acid, AA）负平衡状态下，蛋白利用效率低下，且大量氮（nitrogen, N）通过粪尿排放到环境中。降低日粮CP可提高氮利用效率并减少环境氮排放，但往往以牺牲产奶性能为代价。
赖氨酸（lysine, Lys）是反刍动物的主要限制性氨基酸，也是乳蛋白合成的重要前体。过瘤胃赖氨酸（rumen-protected lysine, RPL）补充可增加十二指肠赖氨酸流量，提高乳腺对其他必需氨基酸（essential amino acids, EAA）的提取效率。然而，以往在不同CP水平下补充RPL的研究结果并不一致。此外，既往研究多关注瘤胃代谢，对后肠微生物发酵与菌群结构的影响知之甚少。
基于此，本研究提出三个假设：（1）RPL补充可维持低CP日粮奶牛的乳蛋白合成；（2）RPL可提高氮利用并减少环境氮排放；（3）RPL补充与不同CP日粮可改变后肠微生物区系。研究目的为评估不同日粮CP浓度（16%与18%，干物质基础）配合RPL补充对奶牛泌乳性能、氨基酸供应、氮利用效率及后肠微生物的影响。
本研究采用2×2双因素试验设计，主效应为日粮CP浓度（16%对18%）和RPL补充（0对40 g/头/天，含68%赖氨酸，生物利用率44%，产品名为LysiGEM，由建明工业提供）。试验选取40头中国荷斯坦奶牛（体重711±55 kg，日均产奶量32.6±3.7 kg，胎次2.1±0.94，泌乳天数163±19 d），随机分为4组（每组10头）：低CP日粮组（LP）、低CP日粮加RPL组（LPL）、高CP日粮组（HP）、高CP日粮加RPL组（HPL）。试验周期为8周，奶牛拴系饲养，自由采食和饮水。RPL在饲喂基础全混合日粮（total mixed ration, TMR）前与少量新鲜TMR混合后单独投喂。
试验流程与样品采集：全试验期间每周连续2天记录干物质采食量（dry matter intake, DMI）。每周测定产奶量，并在3个连续挤奶时段（约03:30、10:30和16:30）按4:3:3比例混合采集奶样，用于乳脂、乳蛋白、乳糖、总固形物、体细胞数和乳尿素氮（milk urea nitrogen, MUN）分析。试验结束时，在饲喂后约2小时从尾静脉采集血液，分离血浆用于血浆尿素氮（plasma urea nitrogen, PUN）测定和血浆游离氨基酸谱分析。饲喂后约3小时通过口腔瘤胃液采样器采集瘤胃内容物，用于瘤胃微生物蛋白（microbial protein, MCP）测定，测定方法基于嘌呤-氮比值法（Zinn and Owens, 1986）。第8周采集点尿样，测定尿总氮、尿尿素氮和肌酐，根据肌酐排泄速率（按体重29 mg/kg）估算日尿量。最后一周连续3天采集粪便8次（约每次100 g），混合后部分酸化烘干用于总氮分析，部分用于挥发性脂肪酸（volatile fatty acids, VFA）分析，另取约3 g粪样冻存于-80°C用于微生物测序。
微生物组分析方法：粪便微生物总DNA采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit提取，使用338F/806R引物扩增16S rRNA基因V3–V4高变区，PCR产物经纯化后在Illumina MiSeq平台测序。原始数据经Trimmomatic质控和FLASH拼接，使用DADA2算法进行扩增子序列变异（amplicon sequence variant, ASV）聚类，采用RDP分类器（置信阈值70%）进行物种注释。Alpha多样性指标包括Chao、Shannon和Sobs指数，Beta多样性基于Bray–Curtis距离的主坐标分析（PCoA）。相关性分析采用Spearman相关系数，通过Majorbio云平台完成，以热图可视化。
数据统计分析：采用SPSS混合模型（mixed procedure），模型包括奶牛、周次、日粮CP浓度、RPL补充、各因素交互作用及残差。重复测量变量（产奶量、乳成分、DMI）使用重复测量程序；体重、血浆氨基酸、氮利用、粪便发酵和微生物数据为单次测量。组间比较采用LSD法，P≤0.05为差异显著，0.05≤0.10为趋势性差异。
日粮MP与氨基酸平衡：根据CPM CNCPS模型估算，LP组和LPL组代谢蛋白（metabolizable protein, MP）供应不足，HP组和HPL组MP达到平衡。LP和HP组赖氨酸占MP比例分别为6.76%和6.78%，低于NRC（2001）推荐的最优水平；RPL补充后LPL和HPL组均达到7.11%。赖氨酸与蛋氨酸比值在LPL和HPL组均达到3:1的推荐比例。
泌乳性能与DMI：RPL补充显著提高DMI（P<0.01，增幅2.82%）、乳蛋白产量（P=0.04）和能量校正乳（energy corrected milk, ECM）（P=0.04），并有提高乳脂产量（P=0.06）和脂肪校正乳（fat corrected milk, FCM）（P=0.05）的趋势。日粮CP浓度对产奶量和乳成分无显著影响，但HP组MUN浓度显著升高（P<0.01）。值得注意的是，RPL对乳蛋白产量的提升效应主要体现在低CP日粮条件下：LPL组乳蛋白产量显著高于LP组，而HPL组与HP组差异不显著。周次×CP×RPL三因素交互作用在乳蛋白百分比（P<0.001）、总固形物百分比（P=0.04）和MUN浓度（P<0.001）上显著。
血浆游离氨基酸：高CP日粮显著提高总EAA、总非必需氨基酸（nonessential amino acids, NEAA）及多数氨基酸（异亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸除外）的血浆浓度（P<0.05）。RPL补充显著提高精氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、总EAA和总NEAA的血浆浓度（P<0.05）。存在CP×RPL交互作用的氨基酸包括蛋氨酸、脯氨酸、总EAA减去赖氨酸（EAA−Lys）和总NEAA（P分别为0.01、0.05、0.01和0.03）。在低CP日粮下，RPL提高血浆蛋氨酸、脯氨酸、EAA−Lys和总NEAA浓度，但在高CP日粮下两组间无差异。这表明RPL在MP不足的条件下对氨基酸供应的改善作用更为明显。
氮利用与瘤胃MCP合成：高CP组氮摄入量显著高于低CP组（P<0.01），且总尿氮排泄显著增加（P<0.01），主要通过尿素氮排泄增加实现（P<0.001）。高CP组乳氮占氮摄入比例显著降低（P<0.01），尿氮占氮摄入比例呈上升趋势（P=0.07）。RPL补充趋于提高乳蛋白氮分泌量（P=0.08）和乳氮占氮摄入比例（P=0.07），并显著降低血浆尿素氮（P<0.001），趋于提高瘤胃MCP合成（P=0.06）。LPL组乳氮占氮摄入比例最高（33.7%），表明低CP日粮配合RPL补充的氮利用效率最优。
粪便发酵特征：RPL趋于降低粪便中乙酸与丙酸比值（P=0.09）和乙酸比例（P=0.08），趋于提高丙酸比例（P=0.08）和戊酸比例（P=0.06）。高CP显著降低乙酸比例和乙酸/丙酸比值（P<0.01），提高丙酸比例（P<0.01）。
粪便微生物多样性与组成：共从40份粪便样本获得2,228,374条序列，对应4,476个ASV。Alpha多样性方面，CP×RPL交互作用在Chao、Sobs和Shannon指数上显著（P<0.05），LPL组数值显著高于LP组，而HP与HPL组无差异。Beta多样性PCoA分析显示LPL组与LP组粪便细菌群落显著分离（P<0.01）。门水平上，RPL显著提高变形菌门（Proteobacteria）相对丰度（P=0.03），降低厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度（P=0.02）。属水平上，RPL显著提高Christensenellaceae_R-7_group（P=0.03）和Acinetobacter（P=0.03）的相对丰度，显著降低Clostridium_sensu_stricto_1（P<0.001）、Turicibacter（P<0.01）和unclassified_f__Peptostreptococcaceae（P<0.01）的相对丰度。高CP提高Paeniclostridium丰度（P=0.04），降低Lachnospiraceae_NK3A20_group丰度（P=0.01）。CP×RPL交互作用在Oscillospiraceae_UCG-005（P<0.01）和Christensenellaceae_R-7_group（P=0.02）上显著，二者在LPL组中丰度升高。
相关性分析：Clostridium_sensu_stricto_1丰度与FCM（r=−0.312）、乳脂产量（r=−0.379）和乳脂率（r=−0.316）呈显著负相关。Oscillospiraceae_UCG-005丰度与FCM（r=0.333）和乳脂率（r=0.339）正相关。Christensenellaceae_R-7_group丰度与乳脂率（r=0.315）和乳蛋白率（r=0.315）正相关。unclassified_f__Peptostreptococcaceae丰度与乳脂产量呈负相关（r=−0.346）。
本研究证明，在低CP日粮（16% CP）条件下补充RPL可平衡氨基酸供应，提高乳蛋白产量和氮利用效率，同时减少以尿素氮为主的氮排放。RPL对乳蛋白合成的促进作用在MP不足的低CP日粮下更为显著，而在MP平衡的高CP日粮下效果有限。此外，RPL在低CP日粮下显著改变后肠微生物组成，增加益生菌Christensenellaceae_R-7_group丰度，降低致病菌Clostridium_sensu_stricto_1和Turicibacter丰度，提示RPL可能通过调控后肠微生态间接改善奶牛健康和泌乳性能。
本研究首次提供了RPL改变奶牛后肠微生物的证据，深化了对过瘤胃氨基酸在瘤胃以外消化道作用的认知。从应用角度看，低CP日粮配合RPL补充为降低蛋白饲料成本、减少环境氮排放同时维持产奶性能提供了可行的营养策略，对奶业可持续发展具有重要实践意义。
本研究的突出之处体现在以下方面：第一，系统整合了从日粮氨基酸平衡、血浆氨基酸谱、氮代谢到后肠微生物组的完整分析链条，构建了“营养干预—代谢响应—微生物变化—生产性能”的逻辑闭环。第二，首次报道RPL对奶牛后肠微生物区系的影响，将过瘤胃氨基酸研究从传统的瘤胃层面拓展至后肠微生态层面。第三，揭示了RPL效应依赖于日粮CP水平（即MP充足性）的差异化特征，为精准营养干预提供了依据。第四，通过相关性分析建立了特定菌属与产奶性能之间的统计学关联，为后续机制研究指明了方向。