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本研究由Cheng Ding、Guoting Chen等来自中国华中农业大学（Huazhong Agricultural University）的团队主导，合作单位包括埃及Benha University和中国农业科学院深圳农业基因组研究所。研究成果于2025年发表在Nature Communications（DOI: 10.1038/s41467-024-53534-5）。
科学领域：基因组学与表观遗传学。
研究动机：真核生物基因组转录产生大量染色质相关RNA（chromatin-associated RNAs, caRNAs），这些RNA通过顺式（cis）或反式（trans）作用参与基因调控和基因组三维（3D）结构组织。然而，现有技术（如CHRD-PET、RED-C）存在样本需求量大、操作复杂、无法同时捕获RNA-RNA相互作用等局限性。
研究目标：开发一种高效、高分辨率的技术（TADRiM-seq），同步分析特定DNA位点的caRNAs及全局RNA-RNA相互作用，并揭示其在昼夜节律中的动态变化。
1. TADRiM-seq技术设计
- 核心创新：结合蛋白G-Tn5（PG-Tn5）靶向DNA标记与原位邻近连接技术，通过以下步骤实现多组学分析：
- 交联与核提取：1%甲醛固定细胞/植物组织，分离完整细胞核。
- 抗体靶向标记：使用特异性抗体（如H3K9ac、CTCF）结合目标蛋白，PG-Tn5携带DNA接头（adapter）标记靶DNA。
- RNA-DNA/RNA-RNA连接：设计5’端腺苷酸化生物素化桥接 linker（bridge linker），连接RNA 3’端与双链DNA，通过原位连接生成嵌合片段。
- 文库构建与测序：反转录、gap-filling、链合成后，PCR扩增并测序（Illumina HiSeq X-ten）。
2. 实验对象与样本量
- 人类细胞：K562（慢性髓系白血病细胞系）、293T细胞，每实验组约1×10^6细胞。
- 植物材料：水稻（Oryza sativa）叶片、拟南芥（Arabidopsis）幼苗，样本量5克（植物组织）。
3. 数据分析流程
- RNA-DNA互作：使用CHRD-PET流程比对数据，MACs2调用峰值，评估特异性（FRiP值）。
- RNA-RNA互作：自定义流程（GitHub公开）包括桥接 linker识别、序列比对（HISAT2）、互作聚类（DG算法）。
- 昼夜节律分析：结合Hi-C数据，比较8:00 AM与8:00 PM的互作网络差异。
4. 对比方法
与CHRD-PET、RED-C等技术相比，TADRiM-seq显著降低样本需求（减少17-20倍），提高分辨率（10 kb级），且兼容长读长测序。
1. 技术验证
- 特异性：TADRiM-seq的DNA峰与CUT&Tag高度重叠（水稻H3K9ac峰值重叠率73%），RNA链特异性明确（如MALAT1反义链富集）。
- 灵敏度：在K562细胞中鉴定到1024个MALAT1-CTCF互作位点，与既往研究一致。
2. 多组学互作图谱
- RNA-DNA互作：在水稻H3K9ac标记区发现22,873个互作簇，其中snRNA/snoRNA偏好远距离（inter-chromosomal）互作。
- RNA-RNA互作：85.1%为分子间互作（如MALAT1-NEAT1），通过RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）验证共定位。
3. 3D基因组关联
- 染色质环锚定：44,585个CTCF相关RNA-DNA互作（77.38%）位于染色质环（loop）锚点区，与活跃转录标记（H3K4me3、RNAPII）正相关。
- 动态网络：昼夜节律基因（如水稻OsLHY）在8:00 AM形成密集互作网络，而夜间呈现分散模式。
4. 昼夜节律调控
- 时间特异性caRNAs：674个RNA在8:00 AM富集（如OsLHY），335个在8:00 PM富集（如lncRNA MSTRG.34836.12）。
- 功能富集：AM互作关联光合作用相关基因，PM互作关联代谢通路。
科学价值：
1. 技术突破：TADRiM-seq首次实现染色质靶向RNA与RNA-RNA互作同步分析，为三维基因组研究提供多组学工具。
2. 生物学发现：揭示caRNAs在染色质环锚定、昼夜节律调控中的动态作用，提出“RNA介导的基因组组织”新模型。
应用前景：
- 农业：解析作物环境适应性（如昼夜响应）的分子机制。
- 医学：靶向RNA-chromatin互作治疗疾病（如癌症异常剪接）。
（报告字数：约1800字）