本研究由Annika K Weimer（通讯作者：Arp Schnittger）等人合作完成，于2016年8月5日在线发表于《The EMBO Journal》。主要合作机构包括法国斯特拉斯堡大学CNRS植物分子生物学研究所、德国汉堡大学生物中心、日本理化学研究所可持续资源科学中心、爱丁堡大学等。
该研究属于植物生物学领域，具体聚焦于细胞周期调控与DNA损伤修复的交叉点。DNA双链断裂是一种严重的DNA损伤类型。在包括酵母和动物在内的许多真核生物中，细胞发生DNA损伤后，通常会抑制细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinases, CDKs）的活性以阻滞细胞分裂，为修复争取时间。然而，近年研究发现，CDK活性本身又是进行DNA修复（尤其是高保真的同源重组修复）所必需的，这形成了一个亟待解释的悖论：细胞如何在分裂阻滞的同时进行需要CDK活性的修复？
在植物中，这一调控机制尚不清晰。植物缺乏动物中关键的DNA损伤检查点激酶CHK1/CHK2的同源物，且其核心细胞周期CDK（CDKA;1）的功能在DNA损伤应答中的作用也不明确。前期研究观察到，一类植物特有的B1型细胞周期蛋白（Cyclin B1， CYCB1），尤其是CYCB1;1，在多种DNA损伤诱导条件下表达上调，但其在损伤应答中的具体功能未知。基于此，本研究旨在探究：植物如何协调DNA损伤后的细胞周期阻滞与修复激活？CYCB1s以及与之互作的CDKs是否在植物DNA损伤应答中扮演关键角色？
本研究采用了多层次的遗传学、细胞生物学、生物化学和分子生物学方法，系统性地解析了CDKB1-CYCB1复合物在拟南芥同源重组修复中的功能。主要流程可分为以下几个部分：
1. 突变体构建与表型筛选 * 研究对象：拟南芥野生型（Col-0， No-0）以及一系列单基因、双基因和三基因突变体。包括：四个CYCB1基因（CYCB1;1, CYCB1;2, CYCB1;3, *CYCB1;4*）的T-DNA插入突变体；两个CDKB1基因（CDKB1;1, *CDKB1;2*）的单突变和双突变体；作为对照的细胞周期核心激酶弱等位突变体*cdka;1-de*；以及已知的DNA修复缺陷突变体，如*ku70*（非同源末端连接缺陷）、*wee1*（复制压力敏感）、*rad51*（同源重组核心蛋白缺陷）、*atm*、*atr*（DNA损伤感应激酶）等。 * 样本量：每个基因型在每次表型分析中至少包含15株幼苗，并进行三次独立的生物学重复。 * 实验与方法：研究人员首先通过PCR鉴定并获得了所有CYCB1的单突变体，并构建了多个双突变组合。通过测量根长作为生长和胁迫耐受性的量化指标，系统评估了这些突变体在不同DNA损伤药物处理下的表型。使用的药物包括：羟基脲（Hydroxyurea, HU，诱导复制压力）、博来霉素（Bleomycin, BLM，诱导DNA双链断裂）和顺铂（Cisplatin，主要诱导DNA链间交联，需HR修复）。特别地，对于顺铂处理，采用了“先正常萌发，后药物转移”的策略（萌发后3天转移），以更精确地评估药物对生长的直接影响。
2. DNA损伤与修复能力评估 * 研究对象：选定的代表性突变体（如*cycb1;1 cycb1;3*、*cdkb1;1 cdkb1;2*）与野生型。 * 实验与方法： * 彗星实验：分离植物细胞核，经顺铂处理及恢复后，进行电泳。DNA断裂会导致核DNA形成“彗星尾”。通过软件量化尾中DNA的百分比，直接评估DNA双链断裂的数量和修复效率。 * γ-H2AX免疫荧光染色：H2AX是组蛋白变体，其Ser139位点在DNA双链断裂处被磷酸化为γ-H2AX，作为DNA损伤的标记。通过免疫荧光显微镜观察并统计每个细胞核中的γ-H2AX焦点数量，以评估DNA损伤的累积程度。 * 同源重组频率体内报告系统：利用一个含有断裂β-葡萄糖醛酸酶（GUS）基因的报告系统。该系统中，功能性的GUS基因需要通过细胞内的同源重组事件才能恢复。通过组织化学染色计数蓝色斑点的数量，可以定量检测体内同源重组事件的发生频率。研究人员将报告系统导入各*cycb1*单突变体背景，在顺铂处理前后统计蓝斑数量。
3. 关键修复蛋白的定位与生化分析 * 研究对象：RAD51蛋白（同源重组核心重组酶）以及CDK-CYCLIN复合物。 * 实验与方法： * RAD51免疫定位：通过免疫荧光技术，观察顺铂处理后野生型及突变体根尖细胞核中RAD51蛋白是否形成焦点（foci），焦点形成是其被招募至DNA损伤位点进行修复的标志。 * 体外激酶实验：在大肠杆菌中表达并纯化了多种拟南芥CDK-CYCLIN复合物，包括CDKA;1-CYCA2;3、CDKB1;1-CYCA2;3、CDKB1;1-CYCD2;1、CDKA;1-CYCB1;1和CDKB1;1-CYCB1;1。以重组RAD51蛋白和组蛋白H1作为底物，在含有放射性标记ATP的体系中进行磷酸化实验。通过SDS-PAGE和放射自显影检测磷酸化信号，确定哪种复合物能够磷酸化RAD51。
4. 调控机制解析 * 研究对象：*CYCB1;1*、*CYCB1;2*、*CDKB1;1*的基因表达，以及转录因子SOG1。 * 实验与方法： * 报告基因构建与观察：构建了*CYCB1;1*和*CYCB1;2*的启动子驱动GFP标记的细胞周期蛋白降解盒（Destruction box）的转基因报告株系，以及*CDKB1;1*启动子驱动GUS的报告株系。在顺铂处理前后，通过荧光显微镜或组织化学染色观察报告基因的表达模式变化。 * 染色质免疫沉淀：利用表达Myc标签SOG1蛋白的转基因植物，在顺铂处理后，使用抗Myc抗体进行染色质免疫沉淀实验，检测SOG1是否直接结合到*CYCB1;1*、*CDKB1;1*、*CDKB1;2*等基因的启动子或特定区域。
5. 遗传互作分析 * 研究对象：构建了同时缺失非同源末端连接关键因子KU70和HR相关因子（*cycb1;1*、*cycb1;2*）的双突变体和三突变体（*cycb1;1 cycb1;2 ku70*）。 * 实验与方法：在BLM处理下，比较这些多重突变体与单突变体（*ku70*、*cycb1;1 cycb1;2*）的根长生长抑制程度，分析NHEJ和HR两条通路在应对DNA双链断裂时的遗传关系是冗余、并行还是相互拮抗。
数据分析流程：对于定量数据（如根长、彗星尾DNA%、焦点数、蓝斑数），均进行至少三次生物学重复，数据以均值±标准差表示。使用Student‘s t检验进行统计学显著性分析，并在图表中以星号标注显著性水平（*P<0.05， **P<0.01， ***P<0.001等）。图像分析使用ImageJ等软件，彗星实验使用专用软件分析。
1. CYCB1和CDKB1突变体特异性地对DNA交联剂顺铂高度敏感。 在HU或BLM处理下，大多数*cycb1*单、双突变体的根长与野生型无显著差异（除了*cycb1;1 cycb1;2*双突变体因基础生长略慢而显短，但对药物的相对敏感性未增加）。然而，在顺铂处理下，所有四个*CYCB1*的单突变体以及它们的双突变组合（除*cycb1;1 cycb1;4*外）的根长均显著短于野生型。同样，*cdkb1;1 cdkb1;2*双突变体对顺铂表现出极其严重的敏感性，根长仅为野生型的约三分之一，而*cdka;1-de*突变体对顺铂不敏感。这表明B1型CDK-CYCLIN复合物在应对DNA链间交联损伤中具有特异且关键的作用。
2. CYCB1和CDKB1突变体累积更多DNA损伤且HR修复能力缺陷。 * 彗星实验显示，顺铂处理及恢复后，*cycb1;1 cycb1;3*和*cdkb1;1 cdkb1;2*突变体的“彗星尾”DNA百分比显著高于野生型，表明它们体内存在更多未修复的DNA断裂。 * γ-H2AX焦点计数显示，顺铂处理后，*cycb1*和*cdkb1*突变体细胞核中的损伤信号焦点数量显著多于野生型，达到与*atm*、*rad51*等已知修复缺陷突变体相当的高水平。 * 体内HR报告系统实验表明，即使在未处理条件下，*cycb1*单突变体中的自发同源重组事件（蓝斑数）就少于野生型。在顺铂诱导下，野生型的HR事件急剧增加，而所有*cycb1*突变体的增加幅度均显著低于野生型，证明其HR修复能力存在缺陷。
3. CDKB1-CYCB1复合物调控RAD51的招募并可直接磷酸化RAD51。 * 免疫荧光显示，顺铂处理后，野生型细胞核中能形成清晰的RAD51焦点，而在*cycb1*和*cdkb1*突变体中，RAD51焦点的形成显著减少，在*cdkb1*双突变体中几乎完全消失。这表明CDKB1-CYCB1复合物对于将核心重组酶RAD51招募至DNA损伤位点至关重要。 * 体外激酶实验结果显示，在测试的多种CDK-CYCLIN复合物中，CDKB1;1-CYCB1;1和CDKA;1-CYCB1;1复合物对RAD51表现出最强的磷酸化活性。这为CDKB1-CYCB1直接调控RAD51功能提供了生化证据。
4. DNA损伤后CYCB1;1的特异性激活受SOG1直接转录调控。 * 报告基因观察发现，顺铂处理能特异性地上调*CYCB1;1*启动子活性（GFP信号增强），且这种上调局限于具有分裂能力的根尖分生组织区域。而*CYCB1;2*及其他B型细胞周期蛋白的报告基因表达未受明显影响。*CDKB1;1*的启动子活性也在顺铂处理后增强。 * ChIP实验证实，在顺铂存在下，转录因子SOG1能直接结合到*CYCB1;1*基因的启动子及UTR区域，但未结合到*CDKB1;1*或*CDKB1;2*的基因区域。这揭示了SOG1通过直接激活*CYCB1;1*的转录来响应DNA损伤。
5. HR与NHEJ通路在植物中至少部分冗余，共同保障强大的DNA修复能力。 * 遗传互作分析发现，*cycb1;1 cycb1;2*双突变体对BLM仅轻微敏感，*ku70*单突变体对BLM高度敏感（因其NHEJ主通路缺陷）。然而，三突变体*cycb1;1 cycb1;2 ku70*对BLM的敏感性远超*ku70*单突变体，其根长生长受到极其严重的抑制。这表明当主要的NHEJ通路（KU70依赖）失效时，CYCB1依赖的HR通路可以作为备份修复机制起作用。两条通路的同时失活导致修复系统崩溃，揭示了植物修复系统的强大源于多条通路的并行与冗余。
本研究得出了一个核心结论：拟南芥通过“分工策略”解决了DNA损伤后既需阻滞分裂又需激活修复的困境。 具体而言，植物利用转录因子SOG1，在DNA损伤后，一方面抑制主要的促有丝分裂CDK活性以实现细胞周期阻滞；另一方面，又直接激活*CYCB1;1*的表达。CYCB1;1与CDKB1形成特异的激酶复合物，该复合物通过磷酸化RAD51等底物，正向调控同源重组修复途径。因此，有丝分裂的“主力”被抑制，而专司修复的“特派”CDK复合物被特异性激活。
科学价值： 1. 机制创新：首次在植物中阐明了CDK活性在DNA损伤修复中的正面调控作用及其具体机制，提出了“分工策略”这一新颖模型，为理解真核生物DNA损伤应答的多样性和进化提供了重要视角。 2. 功能明确：确立了植物特有的CDKB1-CYCB1复合物作为HR修复核心调控模块的关键身份，为植物细胞周期与基因组稳定性维持的交叉研究开辟了新方向。 3. 系统认知：揭示了植物中HR和NHEJ两条修复通路存在功能冗余，这从机制上解释了植物为何能耐受高水平基因毒剂，具有强大的DNA损伤修复能力。
应用价值：该研究为通过遗传工程改良作物对环境胁迫（如辐射、重金属、某些除草剂）的耐受性提供了潜在靶点。通过调控CDKB1-CYCB1模块或相关通路，可能增强植物的基因组稳定性和适应力。
研究还排除了其他类型细胞周期蛋白（如A2型）在顺铂应答中的主要作用，凸显了CYCB1的特异性。同时，通过流式细胞术分析，发现顺铂短期处理并未引起根尖细胞显著的内复制周期转换，进一步支持CYCB1;1的上调是DNA损伤信号导出的特异性转录响应，而非简单的细胞周期阻滞导致的G2期细胞积累效应。这些细致的对照和分析增强了结论的可靠性。