本次为您呈现的研究是一项关于甘蓝型油菜（Brassica napus L.）盐胁迫耐受分子机制的原创性研究，其研究成果发表于journal of advanced research期刊，已于2026年1月在线发表。本研究由来自华中农业大学作物遗传改良全国重点实验室暨国家油菜工程技术研究中心的Ouqi Li、Min Zou、Xianfei Hou、Jiawen Zhao、Hao Zhang、Chao He、Xinyi Fan、Yifei Jin、Yina Ma、Jing Wen、Bin Yi、Tingdong Fu、Jinxiong Shen（通讯作者）以及Lun Zhao（通讯作者）等研究者合作完成。新疆农业科学院作物研究所的Donghai Jia和Yuanguo Gu，以及江汉大学生命科学学院的Heping Wan也参与了此项工作。
本研究的科学领域聚焦于植物逆境生物学，具体涉及盐胁迫应答的分子机理。土壤盐渍化是全球作物生产面临的主要制约因素，超过10亿公顷农田受到盐分影响，造成巨大的经济损失。甘蓝型油菜作为重要的油料作物，不仅在改良盐碱土方面具有潜力，而且其盐胁迫耐受的分子机制尚不完全清晰。先前的研究已鉴定出一些与盐胁迫相关的基因，但对其中甘氨酸富集蛋白（Glycine-Rich Protein, GRP）家族成员的具体功能和调控网络知之甚少。
研究者前期的研究发现了一个盐胁迫诱导基因BnA.GRP3，但其生物学功能和调控机制尚未阐明。因此，本研究旨在系统性地解析BnAGRP3在油菜盐胁迫响应中的功能角色和分子机制。研究目标明确为：1）验证BnAGRP3是否正调控油菜的耐盐性；2）揭示其调控耐盐性的具体途径（例如是否通过维持离子稳态）；3）探索其潜在的相互作用蛋白及信号传导网络，以拓宽对GRP蛋白介导的盐胁迫响应机制的认识。
本研究采用了多学科交叉的综合实验策略，流程严谨，环环相扣。主要可分为以下几个核心步骤：
1. 基因鉴定与系统发育分析： 研究者首先在甘蓝型油菜品种‘Westar’和‘中双11号’（ZS11）中鉴定了BnAGRP3的三个同源基因拷贝，分别命名为BnaA7.GRP3、BnaC7.GRP3.1和BnaC7.GRP3.2。通过序列比对和系统发育树构建，确认它们与拟南芥中的AtGRP3高度同源，且在十字花科中进化保守。这为后续研究提供了基因基础。
2. 表达模式分析与遗传材料创制： 通过实时定量PCR分析，发现BnaA7.GRP3和BnaC7.GRP3的表达均受盐胁迫强烈诱导。为了研究其功能，研究者利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，成功构建了BnAGRP3的单突变体、双突变体和三突变体（bnagrp3#1和bnagrp3#2）油菜材料。同时，通过构建过表达载体，在拟南芥和油菜中分别获得了BnAGRP3以及后续鉴定出的BnPIPs的过表达株系。所有转基因材料均通过PCR和RT-qPCR进行了验证。
3. 表型与生理生化鉴定： 在油菜和拟南芥中分别进行盐胁迫处理（油菜：200 mM NaCl水培；拟南芥：120 mM NaCl培养基）。通过表型观察、生物量（鲜重、干重）测量、以及过氧化氢、丙二醛和脯氨酸含量的测定，系统评估了突变体和过表达株系的耐盐性。此外，还利用硝基蓝四唑染色检测了叶片中超氧阴离子的积累情况。这些实验为证明BnAGRP3正调控耐盐性提供了直接的生理证据。
4. 转录组学分析： 对野生型（WT）和bnagrp3#2三突变体在盐胁迫处理0、4、8小时的叶片组织进行RNA测序。通过差异表达基因分析、基因本体富集分析以及离子转运相关基因表达热图的绘制，深入探究了BnAGRP3缺失如何全局性影响油菜的转录组响应，特别是对Na+/K+稳态相关基因的调控。该分析揭示了BnAGRP3可能通过调节NHX1（液泡Na+/H+交换器）、SKOR（韧皮部K+外向整流通道）等关键离子转运蛋白的表达来发挥作用。
5. 蛋白质互作网络解析： 这是本研究的核心创新环节。研究者首先通过免疫沉淀-质谱联用技术，从过表达BnaA7.GRP3-3×FLAG标签蛋白的油菜幼苗中富集并鉴定了潜在的互作蛋白。质谱分析筛选出606个候选互作蛋白，其中引人注目地包含了四个质膜内在蛋白：BnaA3.PIP2-2, BnaC3.PIP2-6, BnaA1.PIP2-7, 和BnaC3.PIP2-7。随后，利用酵母双杂交、荧光素酶互补成像以及双分子荧光互补等多种体内外互作验证技术，确证了BnAGRP3与这四个BnPIPs在细胞膜上存在直接的物理相互作用。此外，还通过类似方法验证了这些BnPIPs自身能形成同源或异源复合体。
6. BnPIPs功能验证： 为了探究互作蛋白的功能，研究者评估了过表达这四个BnPIPs的拟南芥株系的耐盐性，发现它们均能显著增强拟南芥的盐耐受能力。更重要的是，为了验证BnPIPs是否参与H2O2转运，研究者将这四个基因在酵母中表达，并进行H2O2渗透性试验。结果表明，表达BnPIPs的酵母菌株在含有外源H2O2的培养基上生长更好，生长曲线也显示其耐受性更强，暗示这些BnPIPs可能促进了H2O2的外排，从而降低了细胞内氧化损伤。
7. 离子含量测定： 使用电感耦合等离子体发射光谱仪测定了油菜地上部组织的Na+和K+含量。数据量化地证实了bnagrp3突变体在正常和盐胁迫条件下均存在Na+/K+比率失衡的问题，为转录组分析的结论提供了坚实的生理数据支撑。
1. BnAGRP3是油菜盐胁迫耐受的正调控因子。 表型分析显示，bnagrp3三突变体在盐胁迫下生物量显著降低，氧化损伤标志物（H2O2、MDA）和渗透调节物质脯氨酸含量异常升高，NBT染色显示超氧化物积累更多，表明其耐盐性严重受损。相反，在拟南芥中过表达BnAGRP3能显著提高盐胁迫下的根长和生物量，同时降低氧化损伤和脯氨酸积累。这些结果强有力地证明了BnAGRP3在植物盐胁迫响应中起着积极的保护作用。
2. BnAGRP3的三个同源基因功能冗余。 启动子活性分析和亚细胞定位表明，三个同源基因表达模式相似，且都定位于质膜。更重要的是，单突变体和双突变体在盐胁迫下表型与野生型无显著差异，只有三突变体表现出明显的盐敏感表型。这揭示了在甘蓝型油菜这一多倍体作物中，BnAGRP3的同源基因通过功能冗余共同保障了其在盐胁迫下的适应性，这是多倍体增强环境适应力的一个具体例证。
3. BnAGRP3通过调节离子转运蛋白转录本维持Na+/K+稳态。 转录组分析是揭示机制的关键。比较野生型和突变体发现，BnAGRP3缺失导致大量盐响应基因表达紊乱。GO富集分析特别指出，在突变体中，与Na+转运相关的通路被特异性富集。深入分析离子转运相关基因发现：液泡Na+区隔化关键基因NHX1在突变体中基础表达和诱导表达均较低；负责K+长距离运输的SKOR基因在野生型中受盐胁迫抑制，但在突变体中抑制减弱，且其基础表达本就较低。离子含量测定结果与转录组数据吻合：突变体在正常条件下K+含量就显著偏低，导致Na+/K+比率 already 失衡；盐胁迫后，其Na+积累更多，Na+/K+比率进一步恶化。这些结果表明，BnAGRP3通过正向调控NHX1、负向调控SKOR等关键基因的表达，协同维持细胞内的Na+/K+离子平衡，这是其赋予耐盐性的核心机制之一。
4. BnAGRP3与四个BnPIPs蛋白发生物理互作。 IP-MS及后续的Y2H、LCI、BiFC等系列验证实验，首次鉴定并证实了BnAGRP3与四个质膜定位的PIP水通道蛋白家族成员存在直接的蛋白-蛋白相互作用，且互作发生在细胞膜上。这一发现将GRP与PIP两个蛋白家族在功能上联系起来。
5. BnPIPs通过可能调节H2O2渗透性来增强耐盐性。 功能研究表明，过表达这四个BnPIPs都能提高拟南芥的耐盐性。更重要的是，酵母H2O2耐受实验提供了关键线索：表达BnPIPs的酵母能更好地在外源H2O2环境中生长，暗示这些蛋白可能促进了H2O2的跨膜外排。同时，互作实验证实这些BnPIPs能形成同源或异源复合体，这可能增强了其作为H2O2通道的运输能力。
6. 提出了“BnAGRP3–BnPIP”协同调控模块的工作模型。 基于以上所有结果，研究者整合出了一个工作机制模型：在盐胁迫下，BnAGRP3一方面通过转录调控维持Na+/K+稳态；另一方面，通过与BnPIPs的互作，可能（在未知激酶的参与下）调节BnPIPs的磷酸化状态或活性，从而促进H2O2的质膜外排，缓解氧化压力。值得注意的是，已有的研究表明高浓度的H2O2可以激活SKOR通道。因此，在bnagrp3突变体中，由于BnPIPs功能可能受损导致细胞内H2O2积累，进而反常地激活SKOR，加剧了K+外流和离子失衡。这样，H2O2可能充当了一个信号桥梁，将BnAGRP3介导的离子稳态调节和氧化还原调控这两个过程紧密联系起来。
本研究得出的核心结论是：BnAGRP3是甘蓝型油菜盐胁迫耐受的一个关键正调控因子。它通过双重机制发挥作用：1）转录调控层面：调节NHX1、SKOR等离子转运蛋白基因的表达，直接维持细胞Na+/K+稳态；2）蛋白质互作层面：与四个BnPIP水通道蛋白物理互作，可能通过影响H2O2的跨膜运输来参与氧化还原平衡的调节。这两条通路可能通过H2O2信号相互耦合。
本研究的科学价值重大：首先，它突破了对GRP蛋白传统认知（主要是RNA结合蛋白），揭示了一类膜相关GRP在盐胁迫中通过调控离子稳态和潜在氧化信号的新功能，极大地拓宽了GRP介导的胁迫响应机制框架。其次，首次建立了GRP与PIP两个蛋白家族在盐胁迫响应中的功能联系，提出了全新的“BnAGRP3–BnPIP”调控模块，为理解植物整合离子胁迫与氧化胁迫应答的复杂网络提供了新的视角。最后，研究揭示了甘蓝型油菜多倍体基因组中同源基因功能冗余对增强环境适应性的重要性，为作物遗传改良（如通过基因编辑或聚合优良等位基因培育耐盐品种）提供了重要的候选基因和理论依据。
这项研究是一项深入、系统且具有高度创新性的工作，它不仅显著增进了我们对甘蓝型油菜乃至植物盐胁迫耐受分子机制的理解，而且为作物抗逆遗传改良开辟了新的思路和基因资源。