gli1标记骨形成与骨折修复中的成骨祖细胞
主要作者：Yu Shi、Guangxu He、Wen-Chih Lee、Jennifer A. McKenzie、Matthew J. Silva、Fanxin Long。研究机构：华盛顿大学医学院骨科（Department of Orthopedic Surgery, Washington University School of Medicine）、中南大学湘雅二医院骨科、华盛顿大学医学院医学与发育生物学系。本文发表于 Nature Communications，2017年。
研究背景
哺乳动物的骨形成在一生中持续进行，既包括胚胎期开始并延续至出生后的骨塑建（bone modeling），也包括成熟骨骼中的骨重塑（bone remodeling）。然而，负责产生成骨细胞（osteoblast）的间充质祖细胞（mesenchymal progenitor）的分子标志一直未被明确。既往研究多集中于出生后骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs），这些细胞在体外可形成成纤维细胞集落并具有多向分化潜能，但细胞表面标志复杂且不稳定。研究已发现PDGFRα、Sca-1、Leptin receptor（LEPR）、Gremlin 1（Grem1）、αSMA等标志可富集具有成骨能力的祖细胞，但这些细胞群体存在异质性，且在不同发育阶段和骨骼部位的贡献不一。Hedgehog（HH）信号通路在胚胎软骨内成骨中调控成骨细胞分化，GLI1既是HH信号通路的转录激活因子也是靶基因，可作为HH信号响应的标志。然而，GLI1是否标记出生后长骨中的成骨祖细胞，以及HH信号在出生后骨形成中的生理功能尚不清楚。本研究旨在利用gli1-creERT2小鼠进行谱系追踪，鉴定小鼠骨骼中具有成骨能力的间充质祖细胞，并探究HH信号及Wnt/β-catenin信号对其功能的调控。
研究流程
本研究主要包括以下7个实验环节：
胚胎期gli1+细胞的谱系追踪。使用gli1-creERT2; Ai9小鼠，在胚胎第13.5天（E13.5）给予他莫昔芬（tamoxifen，TM），分别在E14.5、E18.5和出生后2个月取材，观察tdTomato阳性（tdTomato+）细胞的分布与分化命运。
出生后gli1+细胞的谱系追踪。在1月龄小鼠给予TM，于给药后24小时、1个月、3个月和9个月取材，分析股骨、椎骨和颅骨中tdTomato+细胞的定位及其向成骨细胞、软骨细胞和骨髓细胞的分化。
功能验证：gli1+细胞消融实验。利用携带白喉毒素A（diphtheria toxin A，DTA）的等位基因（Rosa-DTA），在1月龄诱导DTA表达以特异性消除gli1+细胞，3周后通过微型计算机断层扫描（microCT，µCT）和组织学分析骨量变化，并检测血清骨形成标志物P1NP和骨吸收标志物CTX-I。
细胞分子特征分析。通过免疫荧光染色检测GLI1+细胞中内皮粘蛋白（endomucin）、聚集蛋白聚糖（aggrecan）、LEPR、PDGFRα、RUNX2、Osterix（OSX）等标志物的表达。利用荧光激活细胞分选（FACS）分离软骨-骨连接区（chondro-osseous junction）的CD31−CD45−TER119−tdTomato+细胞，分析其LEPR和PDGFRα表达。对分选的GLI1+与GLI1−间充质细胞进行RNA测序（RNA-seq），比较间充质干细胞标志基因的表达差异。
HH信号功能研究。在1月龄对gli1-creERT2; Ai9; Smoc/c（Smocko）小鼠和对照小鼠给予TM，10天后分析股骨松质骨参数，并通过EdU增殖实验和OSX免疫荧光染色评估GLI1+细胞的增殖和成骨分化。
Wnt/β-catenin信号功能研究。在1月龄对gli1-creERT2; Ai9; β-cateninc/c（βcatcko）小鼠和对照小鼠给予TM，1个月后通过µCT、组织学和perilipin免疫荧光染色分析骨量、骨髓脂肪细胞数量和尺寸，以及GLI1+细胞向脂肪细胞的分化比例。
骨折修复中的谱系追踪。在1月龄对gli1-creERT2; Ai9小鼠给予TM，10周龄时建立股骨半稳定骨折模型，骨折后10天取材，通过aggrecan和osteocalcin（OCN）免疫荧光染色分析GLI1+细胞向软骨细胞和成骨细胞的贡献。
研究结果
在胚胎期谱系追踪中，E13.5标记的gli1+细胞主要位于软骨膜，E18.5时其子代细胞大量分布于初级骨化中心，出生后2个月时tdTomato+细胞广泛存在于皮质骨、松质骨、颅骨和椎骨的成骨细胞和骨细胞中，并标记部分骨髓脂肪细胞和LEPR+基质细胞。这表明胚胎期gli1+细胞是出生后骨骼多种细胞的重要来源。
出生后谱系追踪显示，1月龄时gli1+细胞分布于关节软骨、生长板上层、生长板两侧软骨膜和生长板下方的软骨-骨连接区。追踪1个月后，生长板下方的tdTomato+细胞扩展至骨小梁表面，表达成骨细胞标志物GFP；3个月时约86%的tdTomato+细胞表达GFP。9个月后，生长板下方的tdTomato+细胞消失，但骨髓中出现tdTomato+细胞，且部分皮质骨骨细胞表达tdTomato。在椎体中，终板下方的gli1+细胞同样产生成骨细胞。这些结果说明出生后gli1+细胞是松质骨成骨细胞的主要来源。
DTA消融实验显示，消除gli1+细胞后股骨远端松质骨骨体积分数（BV/TV）显著下降，血清P1NP降低而CTX-I无变化，且与对照小鼠相比，DTA小鼠在3周内骨小梁数量未增加。证明gli1+细胞对出生后松质骨形成具有功能上的必要性。
细胞特征分析表明，GLI1+细胞位于干骺端血管周围，与内皮细胞和生长板软骨细胞不同。约80%的GLI1+细胞表达PDGFRα，约70%表达RUNX2，约20%表达OSX，而仅有约7%表达LEPR。RNA-seq显示，GLI1+细胞显著富集CD44、CD106/VCAM1、CD146/MCAM、PDGFRA、PDGFRB和ACTA2等间充质干细胞标志基因，但不富集Sca-1/Ly6a或NG2/Cspg4。追踪6个月后，约50%的tdTomato+骨髓基质细胞表达LEPR，约60%表达PDGFRα。追踪3个月后约30%的perilipin+骨髓脂肪细胞来源于gli1+细胞。这些结果证明GLI1标记一种至少具有成骨、成基质和成脂三向分化能力的干骺端间充质祖细胞（metaphyseal mesenchymal progenitors，MMPs）。
RNA-seq的分选策略为：从1月龄gli1-creERT2; Ai9小鼠股骨远端软骨-骨连接区取材，分选CD31−CD45−TER119−tdTomato+（GLI1+）和tdTomato−（GLI1−）间充质细胞，对三对生物学重复进行RNA-seq。
HH信号功能实验中，Smocko小鼠股骨远端BV/TV和骨小梁数量显著降低，骨小梁间距增加，血清CTX-I无变化。EdU实验显示GLI1+细胞增殖率下降，OSX+GLI1+细胞比例减少。表明HH信号是MMPs增殖和成骨分化所必需的。
β-catenin缺失实验中，βcatcko小鼠松质骨BV/TV和骨小梁数量显著降低，皮质骨参数无变化，血清CTX-I正常。组织学显示干骺端脂肪细胞数量增多、体积增大，perilipin+tdTomato+脂肪细胞在总脂肪细胞中的比例由约10%增至约50%。说明β-catenin缺失使MMPs命运向脂肪生成方向转变。
在骨折修复实验中，对侧未骨折股骨仅见少量tdTomato+骨膜细胞，而骨折后10天，骨痂中约63%的aggrecan+软骨细胞和约50%的OCN+成骨细胞表达tdTomato。说明出生后gli1+细胞在骨折愈合中同时贡献软骨细胞和成骨细胞。
结论与意义
本研究通过谱系追踪证明GLI1是绝大多数成骨细胞来源的间充质祖细胞的共同分子标志。出生后生长板下方的GLI1+细胞，即MMPs，对幼年小鼠松质骨形成至关重要。MMPs至少具有成骨、成基质和成脂三向分化能力，并表达多种间充质干细胞标志基因。HH信号对MMPs的增殖和成骨分化具有生理调控功能，β-catenin则调控其成骨与成脂命运的平衡。此外，出生后gli1+细胞在骨折愈合中同时产生软骨细胞和成骨细胞。这些发现为理解出生后骨形成的细胞机制提供了新的分子基础，也为利用间充质祖细胞进行骨再生提供了潜在的靶点。
研究亮点
本研究的亮点在于：（1）首次确定了GLI1作为出生后长骨干骺端成骨祖细胞的标志，并将该细胞群体命名为MMPs；（2）证明了GLI1+细胞具有成骨、成基质和成脂三向分化能力，且在体内可产生LEPR+骨髓基质细胞；（3）阐明了HH信号和Wnt/β-catenin信号在MMPs增殖与分化中的生理功能；（4）揭示了出生后gli1+细胞在骨折修复中同时贡献软骨和骨形成的再生能力。此外，该研究采用了多种条件性基因敲除和细胞消融策略，结合RNA-seq、FACS和体内µCT等手段，从细胞起源、分子特征到功能调控进行了系统性验证。