《Journal of Bacteriology》1990年8月发表的学术研究报告：热带假丝酵母（Candida tropicalis）整合性DNA转化系统的开发

一、作者及研究机构
本研究由美国加州拉霍亚Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc.的Lisa O. C. Haas、James M. Cregg和Martin A. G. Gleeson*（通讯作者）合作完成，发表于1990年8月的《Journal of Bacteriology》第172卷第8期。

二、学术背景
热带假丝酵母（Candida tropicalis）是一种无孢子双形态酵母，具有医学、学术和工业价值。部分菌株是人类机会性病原体，其代谢特性独特——能够以烷烃和脂肪酸为唯一碳源和能量来源，并依赖过氧化物酶体（peroxisome）降解这些底物。然而，由于缺乏遗传操作工具，其分子机制研究受限。本研究旨在开发一种基于同源重组的DNA转化系统，以解决以下问题：
1. 遗传工具缺失：此前缺乏高效的转化方法，无法进行基因编辑；
2. 代谢研究需求：需解析烷烃代谢和过氧化物酶体生物发生的分子机制；
3. 工业应用潜力：该酵母可能成为异源蛋白生产的理想宿主。

研究目标包括：
- 分离热带假丝酵母的尿嘧啶营养缺陷型（ura3）宿主；
- 克隆并表征其ura3基因作为选择标记；
- 建立高效的DNA转化方法，支持基因整合和后续功能研究。

三、研究流程与方法
1. ura3突变宿主的筛选
- 方法：通过化学诱变剂NTG（1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍）处理野生型菌株（ATCC 20336），结合双重筛选策略：
- 制霉菌素（nystatin）富集：杀死生长中的野生型细胞，保留营养缺陷型；
- 5-氟乳清酸（5-FOA）抗性筛选：仅ura3突变体可在含5-FOA的培养基中存活。
- 结果：从100个候选菌落中鉴定出11株尿嘧啶营养缺陷型，其中4株缺乏乳清酸单磷酸脱羧酶（OMP decarboxylase, OMD）活性，最终选择一株低回复突变率（<10⁻⁷）的菌株SU-2作为宿主。

1. 热带假丝酵母ura3基因的克隆与功能验证

   • 克隆策略：构建热带假丝酵母基因组文库（Sau3AI部分酶切片段插入YEp13载体），转化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）ura3缺陷型菌株SHY-3，筛选互补菌落。
     
   • 验证实验：
     
     • 通过质粒回转化确认ura3功能；
       
     • 在大肠杆菌pyrF缺陷株（OMD活性缺失）中验证基因功能。
       
   • 定位分析：通过亚克隆和限制性酶切图谱确定ura3基因位于5.8 kb Sau3AI片段的左端（图1-2）。
     

2. 转化系统的建立与优化

   • 方法对比：
     
     • 原生质体法：使用zymolyase消化细胞壁，CaCl₂-PEG介导DNA导入，转化效率达10³–10⁴/μg DNA；
       
     • LiCl法：全细胞处理，效率较原生质体法低10倍。
       
   • 整合机制：线性化载体（如NruI切割pCU2ΔSaci）通过同源重组整合到基因组ura3位点（图4）。
     

3. 转化子的分析与分类

   • 表型分析：转化子分为大菌落（整合型）和小菌落（自主复制型），后者在非选择性培养基中易丢失。
     
   • Southern杂交验证：
     
     • 单拷贝整合（16 kb新条带）、多拷贝串联整合（>16 kb）和基因转换（野生型条带模式）三种整合事件（图4，lane 2-5）；
       
     • 发现热带假丝酵母基因组存在两个ura3同源位点，但仅一个能被克隆的ura3基因互补。
       

四、主要结果与逻辑关联
1. ura3突变宿主的成功分离：双重筛选策略显著提高突变体获取效率，为后续转化提供理想受体。
2. 物种特异性标记基因的必要性：酿酒酵母ura3基因无法互补热带假丝酵母缺陷，凸显跨物种遗传工具的局限性。
3. 高效整合转化：线性化载体优先通过同源重组整合，为后续基因敲除和替换奠定基础。
4. 双ura3位点的发现：Southern杂交揭示基因组中存在第二个同源序列，可能为假基因或功能冗余位点。

五、研究结论与价值
1. 科学价值：
- 首次建立热带假丝酵母的遗传操作系统，填补了该酵母分子生物学研究的技术空白；
- 为解析烷烃代谢、过氧化物酶体蛋白靶向机制及致病性研究提供工具。
2. 应用潜力：
- 作为工业宿主生产异源蛋白，尤其适合利用烷烃或脂肪酸为底物的发酵工艺；
- 正负双向选择系统（ura3/5-FOA）支持多轮基因编辑。

六、研究亮点
1. 方法创新：
- 结合制霉菌素富集与5-FOA抗性筛选，高效分离ura3突变体；
- 优化原生质体和LiCl转化法，适配热带假丝酵母的生物学特性。
2. 发现特殊性：
- 揭示热带假丝酵母ura3基因与酿酒酵母无显著DNA序列同源性；
- 首次报道该酵母基因组存在双ura3同源位点。

七、其他有价值内容
- 研究得到Henkel Research Corp.的资助，并提及后续可开展过氧化物酶体蛋白靶向序列的体内验证，凸显产学研结合的应用导向。