作者及发表信息
本研究的通讯作者为江南大学未来食品科学中心及生物工程学院的张国强（Guoqiang Zhang）教授，第一作者为Shuaili Chen。研究团队还包括Xiangdi Chen、Yifan Peng、Qinghua Li等多位研究者，他们来自江南大学未来食品科学中心、生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室以及江苏省合成生物学基础研究中心。这项研究成果于2025年9月23日在线发表于国际知名期刊 Advanced Science。
学术背景与研究目的
实验室进化是获取具有优良性状的生物分子和生物系统的重要手段，广泛应用于生物技术、制药和工业领域。然而，生物体自然突变率极低（每代每个碱基约10⁻⁹至10⁻¹¹），导致获得目标性状通常需要漫长的时间。传统的定向进化依赖于体外构建突变文库，并涉及DNA转化和筛选的循环操作，过程劳动密集且规模受限。体内靶向超突变技术通过在生物体内局部提升突变率来解决这些问题，但在基因组位点的应用上，现有工具大多存在突变窗口受限、突变类型单一、脱靶率高以及难以调控等缺陷。例如，广泛使用的Evolvr系统虽然能产生多种核苷酸替换，但其突变窗口通常小于350个碱基对（bp）。
为解决这些问题，本研究旨在开发一种新型的体内诱变系统，该系统需要具备以下特性：拥有更宽的突变窗口以覆盖完整基因或代谢通路；能够产生所有类型的核苷酸替换；具有较低的脱靶率以保证宿主基因组的稳定性；以及具备可调控性，从而在不需要时关闭诱变过程。最终，研究团队希望通过整合高持续合成能力的噬菌体DNA聚合酶与CRISPR-Cas9系统来实现这一目标。
详细研究流程
突变体（Mutator）的构建与初步筛选： 研究首先选择T5和T7噬菌体的DNA聚合酶（DNAPs）作为核心诱变元件。这两种聚合酶属于A家族，具有高持续合成能力。研究人员创造了两种T5 DNAP突变体（T5DNAP3m和T5DNAP4m）和一种T7 DNAP突变体（T7DNAP3m），这些突变体因氨基酸替换而具有错误倾向（error-prone）。将它们与切口酶Cas9（nCas9）通过一段23个氨基酸的连接肽（linker）进行融合表达，构建成融合突变体。为了测试这些融合蛋白的活性，研究者在大肠杆菌（*Escherichia coli*）中构建了报告系统，该报告系统由含有提前终止密码子（L33stop）的壮观霉素抗性基因（*aadA*）和靶向该终止密码子附近位点的sgRNA组成。通过波动分析（fluctuation test）测定回复突变率。结果显示，T5DNAP4m-nCas9融合蛋白的突变率最高，达到野生型菌株的7.08 × 10⁵倍。这些突变体在不同的大肠杆菌菌株（TG1, W3110, MG1655）中均表现出相似的活性趋势，证明了其普适性，其中菌株TG1因生长速率最快被选为后续实验宿主。
突变窗口与突变谱的验证： 为了评估突变窗口，研究者设计了一系列sgRNA，引导nCas9在距报告基因终止密码子不同距离的位置产生切口。实验发现，尽管T5DNAP4m-nCas9的突变率在距切口11 bp内急剧下降，但在11至347 bp的范围内仅呈现缓慢下降。在347 bp处，突变率仍高于9.1 × 10⁻⁸/碱基/代。为进一步扩大窗口，研究人员使用了DNA非特异性亲和力更低的增强型nCas9（e nCas9）。T5DNAP4m-e nCas9和e nCas9-T7DNAP3m突变体在距切口位点长达2000 bp（2 kb）的位置仍能产生约1 × 10⁻⁷/碱基/代的突变率，成功将突变窗口扩展至2 kb。通过下一代测序（NGS）对诱变200代后的培养物进行突变谱分析，证实T5DNAP4m和T7DNAP3m均能产生全部12种类型的碱基替换（包括转换和颠换），并且各自具有不同的突变偏好性。
降低脱靶效应的优化策略： 直接融合的突变体表现出较高的脱靶突变率，可能影响宿主适应性。为降低脱靶率，研究人员采用了MS2噬菌体外壳蛋白（MCP）与其RNA发夹结构（MS2 aptamer）特异性结合的招募策略。他们将MCP与T5DNAP4m或T7DNAP3m融合，同时在sgRNA的茎环结构中插入两个MS2发夹。当sgRNA通过碱基配对引导nCas9到靶点时，MCP融合的DNA聚合酶会被招募到该位点附近。结果显示，MS2介导的招募策略维持了与直接融合相当的靶向突变率，同时使T5DNAP4m和T7DNAP3m的脱靶突变率分别降低了96.8%和54.8%。另一个SpyTag/SpyCatcher分裂锚定系统虽然也降低了脱靶率，但同时显著牺牲了靶向突变活性。因此，MS2-MCP系统被选为最优的共定位方案。
基于dTnpB的转录调控系统构建： 为了实现时空可控的诱变，研究者注意到即使在没有诱导剂四环素的情况下，四环素诱导型启动子Ptet在表达突变体时也存在泄漏表达，导致不可忽略的背景突变。为此，他们引入了基于失活TnpB蛋白（dTnpB）的转录抑制系统。该系统利用来自耐辐射奇球菌（*Deinococcus radiodurans*）的催化失活TnpB（dTnpB D191A）及其向导RNA（gRNA），靶向Ptet启动子序列以阻断转录。通过将增强型绿色荧光蛋白（eGFP）与突变体融合表达来测试调控效果，实验结果表明，在有阿拉伯糖诱导dTnpB表达时，突变体的泄漏表达被有效抑制，荧光强度降至野生型水平，实现了对诱变系统的严密“开关”控制。至此，一套完整的CRISPR-TDNAP辅助的靶向诱变用于可调控实验室进化系统（CTRLE）构建完成。
主要研究结果
CTRLE用于基因组多位点同步进化： 研究者应用CTRLE对大肠杆菌基因组中与抗生素耐药性相关的三个基因——*rpoB*（利福平耐药）、*rpse*（壮观霉素耐药）和*rpsl*（链霉素耐药）进行原位诱变。使用携带单个sgRNA的CTRLE系统，突变频率比野生型提高了约347到98,000倍。当分别在T5DNAP4m-MS2和T7DNAP3m-MS2中装入串联的三个sgRNA表达盒，对三个基因同时进行诱变时，T7DNAP3m-MS2系统在单个基因位点上的突变频率与使用单个sgRNA时相当，而T5DNAP4m-MS2系统的突变频率虽然低1-2个数量级，但依然有效。在为期8天的连续进化实验中，通过逐步增加培养基中三种抗生素的浓度（从0到200 μg/mL）进行筛选，最终富集得到了三个三重耐药突变株（M1, M2, M3）。测序发现这些菌株的*rpoB*、*rpse*和*rpsl*基因上均携带有义突变，且这些突变均位于距切口位点较近的范围内。
CTRLE加速TAT分泌途径的进化： 为了验证CTRLE进化较长通路的能力，研究者选择了大肠杆菌的双精氨酸转位（Twin-arginine translocation, TAT）途径。该途径由*tatA*、*tatB*和*tatC*三个膜蛋白基因组成，负责将完全折叠的蛋白质分泌到周质空间。他们构建了仅靶向*tatC*基因的T5DNAP4m-MS2突变体和包含TAT途径信号肽-绿色荧光蛋白-β-内酰胺酶（TorA-eGFP-β-lactamase）融合蛋白的报告质粒。细胞生长和筛选依赖于氨苄青霉素（ampicillin）抗性和周质荧光强度。经过6天共8轮的连续传代和递增的氨苄青霉素压力（最高400 μg/mL）筛选，获得了4种不同的*tatC*突变体（A, B, C, D）。进一步的深度测序还在tatA和*tatB*基因上发现了突变，其中距切口最远的突变体达到了1531 bp，再次验证了CTRLE的宽突变窗口。最终，这些进化后的菌株周质荧光强度相比野生型提高了超过3倍，表明TAT途径的分泌效率得到了显著增强。
CTRLE在枯草芽孢杆菌和乳酸克鲁维酵母中的应用： 研究者进一步探索了CTRLE的通用性，成功在革兰氏阳性模式细菌枯草芽孢杆菌（*Bacillus subtilis*）168和真核微生物乳酸克鲁维酵母（*Kluyveromyces lactis*）GG799中建立了该系统。在枯草芽孢杆菌中，T5DNAP4m突变体在距切口1 bp处的突变率达到背景的1.2 × 10⁵倍。在乳酸克鲁维酵母中，经过密码子优化并共表达大肠杆菌硫氧还蛋白（thioredoxin, TrxA）后，T7DNAP3m突变体显示出极高的活性，其突变率是宿主背景的5 × 10⁷倍，甚至比Evolvr系统在该宿主中的活性高出约20倍。这些结果强有力地证明了CTRLE是一个高效且在不同工业微生物宿主中通用的定向进化工具。
研究结论与价值
本研究成功开发并验证了一种名为CTRLE的体内靶向超突变系统。该系统通过融合噬菌体T5/T7错误倾向DNA聚合酶与CRISPR-nCas9切口酶，并辅以MS2-MCP招募降低脱靶效应、dTnpB转录抑制实现可调控表达，最终集高突变率、宽达2kb的编辑窗口、全面的突变类型、低脱靶活性和严密的可控性于一体。CTRLE成功应用于大肠杆菌三个基因位点的同步进化以及TAT分泌途径的连续进化，并在枯草芽孢杆菌和酵母中展现了高效性，证实其是一种加速蛋白质、基因元件、代谢通路乃至整个微生物底盘细胞进化的强有力且通用的平台。其应用价值广泛，例如优化微生物细胞工厂以生产高价值化合物（如天然产物、生物燃料、药物），以及加速发现具有改良特性（如稳定性、催化活性、底物特异性）的工业酶制剂。
研究亮点