拟南芥TRB蛋白形成两个紧密相关的复合体以介导H3K4me3去甲基化与转录抑制
主要作者与单位： 本研究由北京师范大学生命科学学院的王琪（Qi Wang）和何新建（Xin-Jian He）主导，合作者包括袁丹阳、卢雨嘉、王鑫、郑昊、李林和陈涉，他们来自北京生命科学研究所和清华大学。该研究成果发表于 Advanced Science 期刊，并于2025年以开放获取形式在线发表。
研究背景与目的： 在真核生物中，组蛋白翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）对转录调控、DNA复制及损伤修复至关重要。其中，组蛋白H3第4位赖氨酸的三甲基化（H3K4me3）通常与转录激活相关，而H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3）则与转录抑制关联。拟南芥端粒重复结合蛋白TRB1、TRB2和TRB3（TRB1/2/3）此前已被发现是多梳抑制复合体2（PRC2）的互作因子，参与H3K27me3的沉积；同时它们也是PWWP-EPCR-ARID-TRB（PEAT）复合体的组分，参与组蛋白乙酰化和H2A去泛素化。此外，TRB蛋白还与H3K4me3去甲基化酶JMJ14及其辅助因子NAC050/052存在相互作用。然而，这些遗传位置和功能各异的互作关系如何在全基因组水平上被协调，以及TRB1/2/3如何参与不同组蛋白修饰的调控，其分子机制尚不清楚。本研究旨在系统鉴定TRB1/2/3所参与的蛋白复合体，并阐明它们调节组蛋白修饰和基因转录的分子机理。
研究流程与主要发现： 为了系统性解析TRB1/2/3的互作网络，研究者首先基于已有的亲和纯化-质谱（AP-MS）数据进行了深度分析。在第一部分，该分析成功鉴定出四个此前未被表征的TRB1/2/3互作蛋白：一个含锌指结构域的蛋白ZDP2，以及三个含同源域（helix-turn-helix, HTH）的同源蛋白HTH1、HTH2和HTH3。通过后续对表达Flag标签融合蛋白的转基因植株进行AP-MS验证，并结合酵母双杂交（yeast two-hybrid）和体外pull-down实验，研究者全面地解析了各组分间的互作关系。结果显示，TRB1/2/3与ICU11是共享亚基，它们与HTH1/2/3特异性结合形成TRHT（TRB1/2/3-Helix-Turn-Helix-Protein）复合体；同时，它们又与ZDP2、NAC050/052及JMJ14特异性结合，形成TRHD（TRB1/2/3-Histone-Demethylase）复合体。两个复合体的特异性亚基之间不存在直接互作，证实了它们是两个独立的复合体。进一步通过凝胶过滤层析实验，证实了这两种复合体在体外均能形成稳定的高分子量复合物。结构域分析表明，TRB1通过其C端coiled-coil结构域与ZDP2互作，而通过包含MYB和GH1结构域的N端区域与其他组分互作。
在第二部分，研究者探究了这两个复合体的生物学功能。通过CRISPR-Cas9技术创制了一系列突变体并进行了表型分析。结果表明，trb1/2/3三重突变体表现出严重的发育缺陷，如植株矮小、无法抽薹，这证实了TRB蛋白在植物发育中的核心作用。hth1、icu11和zdp2单突变体也表现出可见的发育表型。通过构建高阶突变体，例如jmj14/nac050/052/icu11四重突变体，研究者发现TRHD复合体的不同组分协同调控了包括开花时间在内的多个发育过程。RNA深度测序（RNA-seq）分析揭示，在这些突变体中，上调的差异表达基因（DEGs）数量持续超过下调的基因数量，支持了TRHT和TRHD复合体作为转录抑制因子的功能。
在第三部分，研究者利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）技术，对TRHT和TRHD复合体的多个组分（HTH1, TRB1, NAC052, JMJ14, ZDP2, ICU11）的全基因组结合图谱进行了绘制。结果发现，TRHT和TRHD组分的ChIP-seq信号高度相关，表明它们共同占据大量靶基因。通过定义共同结合基因集，研究者确定了7982个TRHT/TRHD共同靶基因。将之与PEAT靶基因（高H3K4me3水平）和PRC2靶基因（低H3K4me3水平）比较发现，TRHT/TRHD的靶基因表现出中低水平的H3K4me3，处于一种介于活跃与抑制之间的中间染色质状态。此外，TRB1和ICU11的ChIP-seq信号与TRHT/TRHD组分的相关性远高于与PEAT或PRC2组分的相关性，这表明在此阶段，它们在TRHT/TRHD复合体中扮演着更关键的角色。
在第四部分，研究者直接验证了TRHT/TRHD复合体对H3K4me3的调控作用。尽管蛋白质印迹（western blot）分析显示全基因组H3K4me3水平在突变体中未发生显著变化，但H3K4me3 ChIP-seq分析揭示，在icu11、trb1/2/3、hth1和jmj14突变体中，特定基因位点上的H3K4me3水平发生了改变，其中上调基因的数量均多于下调基因。尤其是在jmj14突变体中，TRHT/TRHD靶基因中H3K4me3水平升高的比例最高，直接在体内证实了这些复合体介导了依赖JMJ14的H3K4me3去甲基化。一项关键发现是，这种去甲基化在不同靶基因亚群中受到差异性调节：当TRHT/TRHD靶基因与PRC2靶基因重合时，JMJ14依赖的去甲基化作用增强；而当与PEAT靶基因重合时，该作用则受到抑制。这揭示了三种复合体在精细调控组蛋白修饰景观中的协同与拮抗关系。
在第五部分，研究者结合RNA-seq和H3K4me3 ChIP-seq数据进行联合分析，以探究去甲基化依赖与非依赖的转录抑制机制。数据显示，在TRHT/TRHD突变体中表达上调的靶基因里，有一部分（28.95%至64.64%）伴随着H3K4me3水平的升高，证实了通过JMJ14去除H3K4me3是实现转录抑制的重要途径。然而，仍有相当一部分上调的靶基因其H3K4me3水平并未发生改变，这提示复合体还存在不依赖组蛋白去甲基化的转录抑制机制。通过拟南芥原生质体中的荧光素酶（LUC）报告系统，研究者进一步证实，共表达TRB1与其他TRHT/TRHD组分可显著增强对报告基因的转录抑制效果，这种抑制效应在依赖和非依赖H3K4me3去甲基化的两类靶基因启动子上均能观察到。
最后，研究者深入探究了复合体靶向染色质的分子机制。HOMER基序分析发现，TRHT/TRHD组分的结合峰中同时富集了TRB1的端粒盒（telobox）基序和NAC基序，并且含有这两个基序的峰值富集度最高。电泳迁移率变动实验（EMSA）证实，TRB1特异性结合TRB1基序，NAC050特异性结合NAC基序，而HTH1则表现出非序列依赖性的DNA结合能力。共孵育实验表明，NAC050-N或HTH1的加入均可增强TRB1的DNA结合能力并形成更大的蛋白-DNA复合物。体内ChIP-seq数据分析与AlphaFold3结构预测相互印证，支持TRB1/2/3与NAC050/052协同结合DNA的模型。此外，对TRB1结构域的功能分析表明，其N端的MYB结构域主要负责序列依赖性的DNA结合并靶向富含染色质的区域，而GH1结构域起辅助作用。体内互补实验证明，MYB结构域的缺失导致TRB1完全丧失回补突变体发育缺陷的能力，而GH1结构域缺失则部分损害其功能，这与它们在染色质结合中的作用完全吻合。
研究结论与价值： 本研究揭示，拟南芥TRB1/2/3蛋白能够形成两个全新且紧密相关的染色质相关复合体——TRHT和TRHD，它们协同介导H3K4me3去甲基化和转录抑制。研究提出一个工作模型：在TRHD复合体中，序列特异性DNA结合抑制子TRB1/2/3和NAC050/052分别结合TRB基序和NAC基序，共同将复合体锚定到染色质上，并由JMJ14执行H3K4me3去甲基化；而TRHT复合体则通过TRB1/2/3和序列非特异性DNA结合蛋白HTH1/2/3靶向染色质，直接介导转录抑制。两个复合体形成一个正反馈回路，协同强化基因沉默。
该研究的科学价值在于，它阐明了TRB蛋白如何作为调控枢纽，通过形成不同复合体来整合并协调多种组蛋白修饰（H3K4me3、H3K27me3、H4K5ac、H2Aub），从而在全基因组水平上建立了不同层次的染色质状态。它将三种功能各异的复合体（激活型PEAT、抑制型PRC2和新型的TRHT/TRHD）联系在一个统一的调控网络中，为理解染色质修饰的动态与复杂性提供了关键的机制性解释，是表观遗传学领域的一项重要进展。
研究亮点： 本研究的亮点主要体现在三个方面：其一，发现了TRB1/2/3作为三种不同表观遗传复合体（PEAT、TRHT/TRHD和PRC2）的共享组分，扮演了核心调控节点的角色，颠覆了仅将其视为单一复合物亚基的认知。其二，揭示了TRHT和TRHD复合体通过同时利用依赖与非依赖组蛋白去甲基化的双重机制来实现转录抑制，为转录调控的多样性提供了新的见解。其三，发现了TRHT/TRHD介导的去甲基化在PRC2和PEAT靶基因上分别被增强和抑制的“阴阳”调控模式，为不同组蛋白修饰间的协同与拮抗提供了绝佳范例。