学术研究报告：水相中原生肽环化（Native Peptide Cyclization, NPC）的化学选择性酰胺化方法

一、作者与发表信息
本研究的通讯作者为Qiang Zhang（美国纽约州立大学奥尔巴尼分校化学系），第一作者为Huan Chen，成果发表于*Journal of the American Chemical Society*（JACS）2023年12月刊（卷145，页27218–27224）。

二、学术背景
1. 研究领域：本研究属于化学生物学与肽合成领域，聚焦于无保护肽的环化策略。
2. 研究动机：传统肽合成依赖侧链保护基（如-tBu）和末端预修饰（如-COOH→-COSR），步骤繁琐且难以兼容所有20种蛋白源性氨基酸（proteinogenic amino acids）。直接连接未修饰的N端与C端是长期挑战，尤其在水中实现选择性酰胺化。
3. 目标：开发一种无需预修饰、水相中进行的原生肽环化（Native Peptide Cyclization, NPC）方法，简化环肽制备流程，推动大环类 therapeutics 的开发。

三、研究流程与方法
1. 核心设计：
- pH调控选择性：利用氨基酸残基的pKa差异，在pH~3条件下，C端羧酸根（COO⁻）成为最亲核位点，优先与异腈（isonitrile）活化剂结合，形成混合酸酐中间体，随后通过N端半胱氨酸（Cys）的巯基（-SH）进行分子内硫解（thiolysis），最终完成环化。
- 关键步骤：
- C端活化：异腈（如异丙基异腈）在酸性条件下选择性激活C端羧酸根。
- 硫内酯形成：分子内硫解生成硫内酯（thiolactone）中间体。
- N→S迁移：动力学控制的酰胺键形成，完成环化。

1. 实验验证：
   
   • 模型肽筛选：以五肽Cys-Trp-Asn-Tyr-Ala（CWNYA）为模板，优化反应条件（pH 3.2，38°C，水相），环化产率达73%。
     
   • 底物兼容性测试：评估35种线性肽（含蛋白源性、D型及非经典氨基酸），成功环化5至20个氨基酸的肽链，最长环肽（20残基）产率74%。
     
   • 立体选择性分析：通过L/D型氨基酸对比实验，证实NPC对C端立体中心影响极小（除苯丙氨酸外，外消旋化比例<10%）。
     
   • Asp/Glu选择性：C端α-羧酸根的反应性显著高于侧链β/γ-羧酸根（如Glu侧链几乎不反应），但C端Asp因易形成琥珀酸酐（succinic anhydride）导致选择性下降。
     

四、主要结果与逻辑链条
1. pH依赖性：中性pH（7.8）下仅发生N端硫甲酰化（thioformylation），而酸性pH（3-5）下C端优先活化，证实pH是调控选择性的关键。
2. 广谱兼容性：NPC对包括色氨酸（Trp）、天冬酰胺（Asn）等复杂侧链均适用，且可兼容非经典残基（如N-甲基半胱氨酸）。
3. 机制验证：通过中间体捕获（如硫内酯）和竞争实验（如Asp vs. Glu），证实反应遵循C端优先活化→硫解→环化的路径。
4. 应用扩展：
- 一锅法修饰：环化后可直接进行巯基烷基化（如苄基化），无需纯化。
- 多肽并行环化：混合线性肽可同步环化，生成多种独立大环产物。

五、结论与价值
1. 科学意义：NPC首次实现了无需保护基的水相肽环化，突破了传统合成对预修饰的依赖，为复杂环肽的制备提供了通用策略。
2. 应用潜力：简化流程（仅需HPLC纯化线性肽+异腈/水反应）可加速大环类药物（如抗菌肽、靶向肽）的发现与生产。

六、研究亮点
1. 方法创新：
- 首创“pH调控亲核性”策略，实现C/N端的选择性活化。
- 异腈活化剂的高效利用（10当量即可驱动反应）。
2. 技术优势：
- 水相反应避免有机溶剂，符合绿色化学原则。
- 对长肽链（≤20残基）的环化效率显著优于传统方法。

七、其他价值
- 机制深度解析：通过中间体表征（如HPLC/NMR）和竞争实验，明确了Asp侧链活化的局限性，为后续优化提供方向。
- 开源数据：支持信息包含60余种环肽的合成与表征数据，可作为环肽设计的参考数据库。

本研究通过NPC技术重新定义了肽环化的化学逻辑，为化学生物学和药物研发提供了颠覆性工具。