该研究由Linlin Shi、Shuxin Han、Jiamin Fei、Long Zhang、Jonathan W. Ray、Weimin Wang和Yanhe Li等人合作完成，分别来自华中农业大学水产学院、美国凯斯西储大学医学中心、马歇尔大学医学院以及中国水产科学研究院淡水渔业研究中心。该研究于2019年8月26日发表在期刊《Genes》上，题为“Molecular Characterization and Functional Study of Insulin-like Androgenic Gland Hormone Gene in the Red Swamp Crayfish, Procambarus clarkii”。

学术背景

研究聚焦于红螯螯虾（Procambarus clarkii）中的胰岛素样雄性腺激素基因（Insulin-like Androgenic Gland Hormone, IAG）。雄性腺（Androgenic Gland, AG）是雄性甲壳动物特有的内分泌器官，负责调控雄性的一级和二级性征。IAG基因被认为是雄性性分化的关键因子，尤其是在RNA干扰（RNAi）技术的应用下，其在性分化中的作用得到了进一步验证。尽管在多种甲壳动物中已克隆了IAG基因，但关于红螯螯虾中IAG基因的表达模式和功能研究仍然有限。因此，本研究旨在分离红螯螯虾的IAG基因全长cDNA（称为PcIAG），并探讨其在性分化中的功能。

研究流程

1. 实验动物与组织采集
   研究从中国武汉的湖泊中获取红螯螯虾，并在实验室条件下饲养。采集了不同发育阶段的样本，包括卵、幼虫和成体。成体样本中，分别采集了雄性螯虾的睾丸、输精管、雄性腺以及其他神经和消化系统组织。所有样本在液氮中保存。

2. RNA提取与cDNA合成
   使用TRIzol试剂从采集的组织中提取总RNA，并通过逆转录合成cDNA。cDNA样本保存在-20°C以备后续实验。

3. PcIAG基因的扩增与序列分析
   设计特异性引物，通过PCR扩增PcIAG基因片段，并通过RACE技术获得其全长cDNA序列。序列分析使用ORF Finder、BLAST等在线工具进行，预测了PcIAG蛋白的信号肽、B链、C链和A链，并分析了其潜在的糖基化位点和半胱氨酸残基。

4. PcIAG基因的表达模式分析
   使用定量实时PCR（qPCR）技术检测PcIAG基因在不同发育阶段和成体组织中的表达水平。结果显示，PcIAG在雄性腺中表达最高，但在雌性组织和其他雄性组织中也广泛表达。此外，通过Western blot检测了PcIAG蛋白在成体雄性螯虾的生殖和神经系统中的表达。

5. RNA干扰实验
   设计并合成了PcIAG的双链RNA（dsRNA），并将其注射到成体雄性螯虾中，观察其对PcIAG基因表达的干扰效果。实验分为四组，分别注射0.1 µg/g、1 µg/g、5 µg/g和10 µg/g的PcIAG-dsRNA，并在不同时间点采集组织样本，通过qPCR检测PcIAG的表达变化。结果显示，低剂量（0.1 µg/g和1 µg/g）的PcIAG-dsRNA能够有效抑制PcIAG的表达，而高剂量（5 µg/g和10 µg/g）则导致PcIAG表达显著上调。

6. 性致死基因（PcSxl）的表达分析
   在RNA干扰实验后，通过qPCR检测了PcSxl基因的表达变化，以探讨PcIAG是否调控PcSxl。结果显示，PcIAG并未直接调控PcSxl。

7. 组织学观察
   通过组织学切片观察了RNA干扰后睾丸和输精管的发育情况。结果显示，低剂量的PcIAG-dsRNA抑制了精子的成熟和释放，而高剂量则加速了精子的成熟和释放。

主要结果

1. PcIAG基因的序列与结构
   获得了PcIAG基因的全长cDNA序列，长度为1047 bp，编码210个氨基酸的蛋白质。序列分析显示，PcIAG蛋白包含信号肽、B链、C链和A链，并具有潜在的糖基化位点和六个保守的半胱氨酸残基。

2. PcIAG基因的表达模式
   PcIAG在雄性腺中表达最高，但在雌性组织和其他雄性组织中也广泛表达。在发育阶段，PcIAG在孵化后第1至3天和第23天达到表达高峰。

3. RNA干扰效果
   低剂量的PcIAG-dsRNA能够有效抑制PcIAG的表达，而高剂量则导致PcIAG表达显著上调。低剂量干扰抑制了精子的成熟和释放，而高剂量则加速了这一过程。

4. PcSxl基因的表达
   PcIAG并未直接调控PcSxl基因的表达。

结论

本研究首次分离了红螯螯虾的PcIAG基因全长cDNA，并揭示了其在性分化中的重要作用。研究表明，PcIAG在雄性腺中高表达，并在精子的成熟和释放过程中发挥关键作用。RNA干扰实验进一步证实了PcIAG在雄性性分化中的功能，并为单性育种提供了理论依据。

研究亮点

1. 首次分离红螯螯虾的PcIAG基因全长cDNA，并对其序列和结构进行了详细分析。
2. 揭示了PcIAG在精子成熟和释放中的关键作用，并通过RNA干扰实验验证了其功能。
3. 发现了PcIAG在雌性组织中的广泛表达，这为理解IAG基因的表达模式提供了新的视角。
4. 为红螯螯虾的单性育种提供了理论基础，具有重要的应用价值。

其他有价值的内容

研究还发现，PcIAG的表达在孵化后第1至3天和第23天达到高峰，这表明红螯螯虾的性分化可能在孵化后的早期阶段就已开始。此外，研究还探讨了PcIAG与PcSxl基因的关系，为进一步研究甲壳动物的性分化机制提供了新的方向。