水稻叶斑病病原菌Bipolaris oryzae中MAP激酶基因bmk1对分生孢子形成及致病性的调控作用研究

作者及机构
本研究由日本岛根大学生命与环境科学系的Akihiro Moriwaki、Junichi Kihara（通讯作者）、Chie Mori及Sakae Arase合作完成，发表于2007年的《Microbiological Research》期刊（卷162，页码108-114）。

学术背景
Bipolaris oryzae是水稻褐斑病的致病菌，其分生孢子（conidia）的形成受近紫外光（NUV，300–400 nm）诱导。此前研究发现，NUV可上调该菌中黑色素合成基因、光解酶基因等的表达，但其信号传导机制尚不明确。丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase, MAPK）是真菌中调控发育与致病性的关键信号分子，如酿酒酵母的Fus3/Kss1同源基因在多种植物病原真菌中参与分生孢子形成、侵染结构分化等过程。本研究旨在揭示B. oryzae中MAPK基因bmk1的功能，探究其在分生孢子形成和致病性中的作用。

研究流程
1. 基因克隆与序列分析
- 实验设计：基于Cochliobolus heterostrophus的MAPK基因chk1设计引物，通过PCR从B. oryzae基因组DNA中扩增bmk1片段，并筛选cDNA文库获取全长序列。
- 技术方法：使用非放射性标记系统（DIG标记）进行Southern blot验证基因拷贝数；通过ClustalW和BLAST进行序列比对及系统发育分析。
- 结果：获得1.3 kb的bmk1基因，编码352个氨基酸，与Botrytis cinerea的bmp1（91%同源性）、C. heterostrophus的chk1（96%同源性）等高度相似，属于Fus3/Kss1类MAPK家族。

1. 基因敲除与表型分析

   • 载体构建：利用含潮霉素抗性基因的载体pSH75构建敲除载体pSHGDMA，通过同源重组置换bmk1基因。
     
   • 转化与筛选：野生型菌株D9/F6-69经转化后，筛选获得两个敲除突变体（bmk1-1和bmk1-2），Southern blot验证其整合模式。
     
   • 表型观察：
     
     • 菌丝生长：突变体菌落气生菌丝减少，生长速率（13.4 mm/天）显著低于野生型（19.5 mm/天）。
       
     • 分生孢子形成：野生型在NUV照射后形成分生孢子，而突变体仅产生异常分生孢子梗，无成熟孢子。
       
     • 致病性：野生型接种水稻叶片后形成典型坏死斑，突变体则完全丧失致病性，即使通过伤口接种亦无法侵染。
       

2. 分子机制探讨

   • 系统发育树显示，bmk1与C. heterostrophus的chk1及Pyrenophora teres的ptk1聚为一支，提示这些病原菌可能通过保守的MAPK通路调控分生孢子形成。
     

主要结果与逻辑关联
- 基因敲除导致菌丝生长缺陷、分生孢子形成完全抑制及致病性丧失，表明bmk1是B. oryzae发育与致病的关键调控因子。
- 突变体表型与C. heterostrophus的chk1突变体相似，但不同于Magnaporthe grisea的pmk1（仅影响附着胞形成），说明不同真菌中Fus3/Kss1类MAPK的功能存在分化。

结论与价值
1. 科学意义：首次证实bmk1在B. oryzae中同时调控分生孢子形成和致病性，拓展了对MAPK信号通路在病原真菌中功能多样性的认知。
2. 应用潜力：bmk1可作为靶点设计新型杀菌剂，通过干扰分生孢子产生或致病性控制水稻褐斑病。

研究亮点
- 创新性方法：采用NUV诱导分生孢子的实验体系，结合基因敲除与表型分析，明确bmk1的多重功能。
- 关键发现：bmk1是少数已知同时调控营养生长、无性繁殖和致病性的MAPK基因之一。

其他价值
研究还提示B. oryzae可能存在其他MAPK通路（如Mps1、Hog1类），未来需进一步解析其信号网络。此外，bmk1是否参与NUV响应仍需验证，为光信号与致病性关联研究提供方向。