产黄青霉对工业规模基质与溶解氧梯度局部及全局扰动的生理响应研究报告

一、研究概况

本研究由华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室的王冠（Guan Wang）课题组主导，联合荷兰代尔夫特理工大学（Delft University of Technology）生物技术系的Cees Haringa团队共同完成。第一作者为陈怡宁（Yining Chen），通讯作者为王冠。该研究成果发表于生物技术与生物工程领域权威期刊 *Biotechnology and Bioengineering*，于2025年正式刊出（第122卷，第1402至1423页），文章DOI为10.1002/bit.28968。

二、研究背景与目的

工业规模微生物发酵过程普遍面临混合与传质限制，导致生物反应器内部形成显著的环境梯度，主要包括基质（如葡萄糖）浓度梯度和溶解氧（Dissolved Oxygen, DO）浓度梯度。这些梯度迫使微生物在时间和空间上经历高度异质的培养条件，从而引发“放大效应”，即从实验室规模放大到工业规模时，产物效价、速率和收率通常下降10%至30%，甚至导致批次完全失败。产黄青霉（*Penicillium chrysogenum*）作为青霉素工业生产的主要菌株，其代谢状态对葡萄糖和溶解氧的波动尤为敏感。已有研究表明，单一的基质波动或单一的氧波动均会导致青霉素生产率显著下降，但在真实工业反应器中，基质梯度和溶解氧梯度往往同时存在且相互耦合，因此仅模拟单一梯度不足以全面反映细胞的真实代谢响应。

针对这一问题，本研究旨在基于工业规模青霉素发酵罐的计算流体力学（Computational Fluid Dynamics, CFD）模拟数据，设计合理的缩小规模（scale-down）实验系统，同时模拟基质与溶解氧的局部极端环境和全局耦合波动，系统评价产黄青霉在组合梯度下的代谢响应规律。具体目标包括：明确进料口附近高葡萄糖低氧（High Glucose Low Oxygen, HGLO）区域和通气口附近高氧低葡萄糖（High Oxygen Low Glucose, HOLG）区域各自对青霉素生产能力的独立影响，以及全局周期性葡萄糖与氧波动（Global Fluctuations in Glucose and Oxygen, GFGO）对细胞代谢和产物合成的综合效应。

三、研究设计与实验流程

本研究以产黄青霉Wisconsin 54-1255为研究对象，采用葡萄糖限制的恒化培养（chemostat）体系作为基础平台，所有实验独立重复三次以确保结果可重复性。整个研究设计了四组平行实验：对照组（Control）、HGLO条件组、HOLG条件组和GFGO条件组。培养过程分为三个阶段：稳态期（0–100小时）、实验期（100–200小时）和恢复期（200–300小时）。稳态期与恢复期均维持与对照组相同的标准培养条件，仅在实验期施加特定的扰动模式。

HGLO条件模拟工业反应器进料口附近的极端环境：在每个150秒周期内，前15秒以对照10倍的速率脉冲式补加葡萄糖，后135秒停止补料，以维持平均补料速率与对照一致；同时通过三路质量流量控制器将进气氧分压维持在约1%，使溶解氧浓度低于0.012 mM（3%饱和度），而胞外葡萄糖浓度始终高于20 mM。该条件完全符合CFD模型预测的进料口区域的高基质、低氧特征。

HOLG条件模拟通气口附近的环境：补料方式与HGLO组相同，但进气氧分压维持在约17.5%，溶解氧稳定在0.2 mM（50%饱和度）左右。由于每个周期内葡萄糖浓度在最后30秒降至0.8 μM以下，而整个周期中葡萄糖浓度从未超过296.97 μM的过剩阈值，因此该条件涵盖了工业反应器顶部搅拌桨以下区域的基质饥饿与氧充足特征。

GFGO条件模拟细胞在反应器内循环时所经历的全局耦合波动：采用360秒周期，前36秒以10倍速率补糖，后324秒停止补料；同时在第75秒至第285秒通入高纯空气，在第285秒至第435秒通入高纯氮气，从而在周期内交替形成约45秒的HGLO阶段和约75秒的HOLG阶段。实验期间，在最后两个周期内以15秒间隔密集采样，以捕捉胞内和胞外代谢物浓度的动态变化。

在分析方法上，研究采用了基于冷钢珠结合液氮的快速取样淬灭技术，以最大限度减少胞内代谢物在取样过程中的变化。胞内代谢物通过同位素稀释质谱法（Isotope Dilution Mass Spectrometry, IDMS）进行定量校正，使用来自毕赤酵母（*Pichia pastoris*）补料分批培养的U-¹³C标记细胞提取物作为内标。氨基酸、磷酸糖、有机酸和糖醇等代谢物通过气相色谱-质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS）分析，青霉素G、苯乙酸（Phenylacetic Acid, PAA）及其副产物则通过反相高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography, HPLC）测定。胞质游离NADH/NAD⁺比值利用TCA循环中C4化合物（天冬氨酸和苹果酸）的平衡池进行计算。此外，研究还使用产黄青霉的基因组尺度代谢模型（Genome-scale Metabolic Model, GEM）结合通量平衡分析（Flux Balance Analysis, FBA）估算胞内代谢通量分布，并利用正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis, OPLS-DA）对目标代谢组学数据进行多元统计分析。

四、主要实验结果与逻辑关系

在HGLO条件下，菌体生物量较对照下降约42.1%，PAA的比消耗速率下降约79.3%，青霉素产量和生产率在实验期内逐渐降至接近零。与此同时，副产物6-氧代哌啶-2-羧酸（OPC）的积累量达到对照的两倍，其比生产速率增加约2.6倍，而邻羟基苯乙酸（o-OH-PAA）的生成几乎停止。这归因于催化PAA转化为o-OH-PAA的苯乙酸羟化酶需要氧气参与，极低氧条件下该酶活性受到严重抑制。进入恢复期后，生物量仍比对照低约14.7%，青霉素产量虽有所回升但未能完全恢复，表明长期暴露于临界氧浓度以下的低氧环境对细胞造成了不可逆的生产能力损伤。这一结果与文献报道的低氧不可逆损伤现象一致。

HOLG条件下，几乎所有测定的生理指标（包括生物量、前体消耗、产物合成和副产物生成）与对照相比均无显著差异，波动幅度不超过10%。然而在恢复期，生物量较对照下降约9.3%，青霉素比生产速率每12小时平均下降0.67%，同时o-OH-PAA的胞外浓度和比生产速率逐渐上升。这表明在低葡萄糖高氧区随机运动的细胞并未丧失生产能力，但由于能量需求增加，出现了提前退化的迹象。由于PAA通过被动扩散进入细胞并具有毒性，细胞需要额外能量通过外排或羟基化进行解毒，这种能量的额外消耗可能导致了代谢负担。

GFGO条件下，生物量得率较对照显著下降约16.2%，PAA胞外浓度约为对照的2.6倍，其比消耗速率下降约77.9%。青霉素胞外浓度下降约63.9%，生产容量降低约53.3%，介于HGLO和HOLG条件之间。OPC的积累超过对照三倍以上，其比生产速率增加约3.6倍，高于HGLO条件下的水平。o-OH-PAA积累量增加约23.9%，比生产速率增加约76.5%，提示龙胆酸途径被激活以降解PAA。与HGLO不同，GFGO恢复期内PAA比消耗速率和青霉素比生产速率均恢复到对照水平，这表明氧受限的暴露时长（GFGO中每周期45秒，而HGLO中每周期150秒）是决定损伤是否可逆的关键因素。

在中心碳代谢层面，HGLO条件下胞内葡萄糖浓度持续上升，糖酵解途径中葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸水平分别下降约47.8%和31.3%，而磷酸戊糖途径中景天庚酮糖-7-磷酸增加约31.3%，表明碳流偏向磷酸戊糖途径。储存性碳水化合物如海藻糖、阿拉伯糖醇和赤藓糖醇分别增加97.1%、632%和77.0%，TCA循环中间体α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸和苹果酸增加两至三倍，同时乙醛酸旁路被显著上调以维持氧化还原平衡。值得注意的是，α-酮戊二酸的胞外浓度较对照增加约50倍，而TCA循环下游的琥珀酸、延胡索酸和苹果酸胞外浓度变化相对较小，说明TCA循环中主要产生还原力的步骤受到严重损害。胞内代谢通量分析显示，HGLO条件下EMP途径和TCA循环通量分别下降约30%和50%，乙醛酸旁路占TCA循环总通量的比例升高，与胞内更高的还原态（NADH/NAD⁺比值升高）一致。

GFGO条件下，在一个周期内胞内葡萄糖水平呈现先快速上升后缓慢下降的模式，峰值出现在HOLG阶段约180秒处，滞后于胞外基质浓度峰值约70秒，这主要由于低氧阶段ATP供应不足导致葡萄糖磷酸化受阻。EMP途径和PP途径的代谢物峰值均出现在既无基质限制也无氧限制的窗口期。TCA循环碳含量波动幅度远小于EMP途径，且其峰值几乎与胞外基质浓度峰值同步出现，说明细胞对前一周期的环境波动需要约240秒才能在TCA循环水平上体现。储存性代谢的碳比例始终维持在对照的近两倍水平，表明细胞通过大量合成海藻糖和糖醇来缓冲即将到来的基质饥饿期。

氨基酸代谢方面，HGLO条件下胞内谷氨酸水平下降约25%，谷氨酰胺增加约48.5%，α-氨基己二酸增加三倍。GFGO条件下天冬酰胺增加72.9%，半胱氨酸减少89.8%，芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）分别下降30.6%、41.3%和10.3%。这些变化反映了细胞在应对组合梯度时对氮同化和前体供应的优先调控策略。

五、结论与科学价值

本研究通过设计基于CFD模拟的缩小规模实验系统，首次系统比较了工业规模青霉素发酵中局部极端环境（HGLO和HOLG）与全局耦合波动（GFGO）对产黄青霉代谢和生产的差异化影响。研究得出以下核心结论：单独的基质梯度不会导致不可逆的细胞损伤，但大幅度的基质波动会降低青霉素生产率；氧梯度不仅降低总产量，还可能导致不可逆的细胞损伤，且损伤程度与低氧暴露时长直接相关。此外，细胞在全局耦合波动下通过周期性调控代谢通量、大量积累储存性碳水化合物和激活乙醛酸旁路等策略来维持能量与氧化还原稳态，但由于无效循环消耗额外能量，青霉素生产能力仍损失近50%。

本研究的科学价值在于揭示了基质梯度与氧梯度之间的耦合效应及各自对细胞代谢的不同贡献，为工业生产中优化搅拌与通气策略提供了理论依据。其应用价值体现在：通过识别进料口区域长期暴露于HGLO条件是导致生产能力不可逆损失的关键区域，建议在实际工业发酵中通过改进进料方式或局部增强供氧来缩短细胞在该区域的停留时间。同时，研究中建立的快速取样与代谢组学分析流程和对代谢通量的动态解析，为后续菌株工程改造提供了可操作的目标途径，例如增强储存性碳水化合物代谢效率或提高乙醛酸旁路的通量调节能力，从而缓解工业放大过程中的生产损失。

六、研究亮点

本研究的突出亮点包括：第一，基于CFD模拟数据精确设计了同时耦合基质和溶解氧梯度的缩小规模实验系统，较以往单一梯度研究更接近工业真实环境；第二，通过代谢组学、通量平衡分析和氧化还原状态测定的多层面整合，系统描绘了细胞在不同扰动模式下的动态代谢响应图谱；第三，揭示了氧受限暴露时长是决定损伤可逆性的关键参数，为工业过程控制提供了明确的临界阈值参考；第四，发现细胞在不同微环境中采用差异化代谢策略，如HGLO条件下偏向磷酸戊糖途径和乙醛酸旁路，而GFGO条件下则大量积累储存性碳水化合物以缓冲基质波动，这种策略的多样性深化了对工业发酵异质性的生物学理解。