类型a：学术研究报告
1971年12月，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 期刊（第68卷第12期）发表了由威斯康星大学酶研究所、生物化学与遗传学系的V. A. Erdmann、S. Fahnestock、K. Higo和M. Nomura合作完成的研究论文，题为《Role of 5S RNA in the Functions of 50S Ribosomal Subunits》。这项研究聚焦于核糖体大亚基（50S）中5S RNA的功能，通过重构实验首次明确证明了5S RNA是50S亚基发挥生物学活性的必需成分。
学术背景
5S RNA是50S核糖体亚基的重要组成部分，但其具体功能长期未知。早期研究发现，去除5S RNA会导致50S亚基失活，但无法通过重新添加5S RNA恢复活性，因此无法确定失活是否直接由5S RNA缺失引起，还是因实验处理导致的结构破坏所致。本研究利用*Bacillus stearothermophilus*（嗜热脂肪芽孢杆菌）的50S亚基重构系统，首次实现了从完全解离的组分（不含5S RNA的蛋白质和23S RNA）中重构功能性50S亚基，并明确证明了5S RNA的不可或缺性。研究目标包括：(1) 验证5S RNA对50S亚基功能的影响；(2) 探究5S RNA缺失对多肽合成、肽基转移酶活性、G因子依赖的GTP结合等关键功能的影响。
研究流程与方法
材料制备
- 核糖体提取：从B. stearothermophilus 799的早对数期细胞中提取70S核糖体，通过超速离心分离50S亚基。
- 组分分离：用8 M尿素-4 M LiCl处理50S亚基，分离出含23S RNA和少量5S RNA的“RNA50”组分，以及含大部分蛋白质和70% 5S RNA的“TP50”组分。
- 5S RNA去除：通过LiCl反复沉淀去除RNA50中的5S RNA；通过DEAE-纤维素色谱法去除TP50中的5S RNA，得到无5S RNA的蛋白质组分。
重构实验
- 将无5S RNA的RNA50与TP50混合，加入纯化的5S RNA，在60°C下孵育60分钟，重构“50S”颗粒。通过蔗糖密度梯度离心验证重构颗粒的完整性（沉降系数47S，接近天然50S亚基）。
功能检测
- 多肽合成活性：测定重构颗粒在poly(U)（聚尿苷酸）和噬菌体F2 RNA指导下的苯丙氨酸（Phe）和缬氨酸（Val）掺入活性。
- 肽基转移酶活性：通过fMet-puromycin（甲酰甲硫氨酸-嘌呤霉素）形成实验检测。
- G因子依赖的GTP结合：在梭链孢酸存在下测定[³H]GTP与50S亚基的结合。
- 终止因子R1依赖的[³H]UAA结合：评估50S亚基在翻译终止中的作用。
- tRNA结合实验：采用硝酸纤维素膜过滤法和RNase保护法检测Phe-tRNA与30S-50S复合物的结合。
主要结果
5S RNA是50S亚基功能的核心组分
- 无5S RNA的重构颗粒（[-5S]颗粒）在poly(U)指导的多肽合成中活性仅为含5S RNA颗粒（[+5S]颗粒）的1%，且无法支持F2 RNA指导的蛋白合成。
- 肽基转移酶活性下降至[+5S]颗粒的14%，表明5S RNA缺失直接影响肽键形成。
- GTP结合和UAA结合活性分别降至17%和10%，说明5S RNA参与G因子和终止因子的功能调控。
- tRNA结合实验中，[-5S]颗粒无法形成稳定的70S复合物，仅保留20%的活性。
结构分析
- 在低Mg²⁺浓度（0.3 mM）下，[-5S]颗粒沉降系数（44S）低于[+5S]颗粒（47S），表明其结构松散；高Mg²⁺浓度（10 mM）可部分恢复结构紧密度。
- 二维凝胶电泳显示，[-5S]颗粒缺失4种50S核糖体蛋白，这些蛋白的缺失可能是功能丧失的原因之一。
结论与意义
本研究首次通过重构实验证明，5S RNA是50S核糖体亚基组装和功能的核心元件，其缺失导致多肽合成、肽基转移酶活性、翻译终止及tRNA结合等关键功能全面受损。5S RNA可能通过维持50S亚基的结构完整性，确保特定蛋白质的正确结合，从而间接调控功能。此外，5S RNA中与tRNA互补的序列（-CGAAC-）可能直接参与tRNA结合，但需进一步验证。
研究亮点
- 方法创新：首次建立依赖5S RNA的50S亚基重构系统，解决了早期研究无法区分“5S RNA缺失”与“结构破坏”的难题。
- 功能全覆盖：系统评估了5S RNA对50S亚基所有已知功能的影响，数据全面。
- 结构-功能关联：揭示了5S RNA通过维持亚基结构和蛋白招募间接调控功能的机制。
其他价值
研究为核糖体结构与功能的深入研究提供了新模型，并为靶向5S RNA的抗生素设计提供了理论依据。文末补充说明，即使5S RNA残留量极低（%），[-5S]颗粒仍保留部分活性，提示5S RNA可能非唯一功能决定因素，需进一步探索其协同作用机制。