针对 Candida viswanathii 的高效 CRISPR 基因组编辑工具包开发及应激响应蛋白 G144 功能分析
本报告将系统性地介绍一篇发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》期刊（2026年卷11期，第298-308页，在线发表日期为2025年10月1日）的研究论文。该研究由上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室的李新悦、李凯、张凤丽、赵心清（通讯作者）和白凤武，日本神户大学的Tomohisa Hasunuma和Akihiko Kondo，以及中国石化大连石油化工研究院有限公司的张琳等人共同完成。这项研究聚焦于非传统酵母菌株的合成生物学工具开发与应用，主要贡献在于为工业重要酵母 Candida viswanathii 建立了一套高效、可迭代的基因组编辑系统，并利用该系统对一个与生物合成过程相关的关键蛋白进行了深入的功能解析。
学术背景 研究领域属于合成生物学、微生物代谢工程与非传统酵母遗传操作技术。Candida 属的酵母在工业生物技术中扮演着重要角色，被用于生产酶、高附加值化学品和单细胞蛋白。其中，Candida viswanathii 因其能够利用烃类和脂肪酸类化合物，在生物修复、脂肪酶生产以及中长链二元酸（如十二烷二酸，Dodecanedioic Acid, DDA）的生物合成中显示出巨大潜力。DDA是生产尼龙、树脂等高性能材料的关键单体，其生物法合成相较于传统石化路线更具环境友好性和可持续性，已实现工业化生产。
然而，Candida 属酵母的遗传操作面临诸多挑战：首先，许多物种如 C. viswanathii 是二倍体且不发生减数分裂，每个等位基因需要分别靶向改造，操作复杂。其次，它们属于CTG分支，其CTG密码子被重新分配以编码丝氨酸而非亮氨酸，这可能导致外源基因表达时出现翻译错误或效率低下。最后，其DNA修复机制中非同源末端连接占主导地位，而高效的同源定向修复能力较弱，使得精确的基因编辑异常困难。尽管此前有研究利用瞬时CRISPR-Cas9系统在 C. viswanathii 中实现了60%的编辑效率，但在迭代编辑、多重编辑和多拷贝基因整合方面仍缺乏有效工具。此外，在前期工作中，研究者发现一个与酿酒酵母Ena1（钠/钾输出P型ATP酶1）相似的蛋白G144，在DDA发酵过程中转录水平显著上调，但其具体功能及其与DDA生产的关系尚不清楚。因此，本研究旨在：1) 开发一套适用于 C. viswanathii 的高效、可迭代、支持多重编辑和多拷贝整合的CRISPR基因组编辑系统；2) 利用该新系统，对Ena1-like蛋白G144进行功能表征，探究其在胁迫响应和DDA合成中的作用。
详细工作流程 本研究包含紧密关联的两大主线：工具包开发和功能验证。工作流程可概括为以下几个核心步骤：
第一步：内源强启动子筛选与菌株基础特性评估。 研究以 C. viswanathii CICC 33310（简称CV310）为对象。首先，为构建高效表达元件，从CV310基因组中筛选了8个常用酵母启动子（PTEF2, PADH2, PENO1, PADH1, PAOX2, PFBA1, PPGK1, PTDH1），通过驱动绿色荧光蛋白报告基因来评估其强度。使用荧光显微镜和酶标仪进行定性和定量分析。同时，对CV310的同源重组效率进行了评估，通过共转化含有同源臂的线性化载体和修复片段，统计成功修复GFP的报告基因的菌落比例，以量化其同源定向修复效率。此外，考虑到非同源末端连接可能干扰CRISPR编辑，研究构建了靶向 ku70 基因（NHEJ关键蛋白）的敲除质粒，旨在创建HDR效率提升的背景菌株（CV310Δku70），并评估了其生长曲线，确保基因操作不影响基本生理。
第二步：建立并优化CRISPR/Cas9基因组编辑系统。 研究测试并比较了多种策略。首先，尝试了基于线性CRISPR-geminin平台（此前在Scheffersomyces stipitis中成功应用）的策略，构建了靶向 pox5 基因的敲除质粒，通过电穿孔法转化CV310，验证其编辑效率。该策略实现了100%的编辑效率，并引入了Cre/loxP系统用于筛选标记的循环利用。然而，该平台存在大质粒构建效率低、PCR突变等问题。
其次，研究转向经典的CRISPR/Cas9与供体DNA片段共转化策略。以 C. tropicalis 的pCT-tRNA系统为骨架，研究者进行了关键优化：1) 启动子优化：将Cas9基因的启动子替换为CV310自身的强启动子 *TDH1*，构建了pXY1-Cas9系列质粒；将指导RNA的启动子也替换为CV310来源的强启动子（如 *PGK1, ENO2, TDH3*），构建了pXY101-103-Cas9-pox5等变体；还将线性CRISPR-geminin平台中的Cas9-geminin和sgRNA元件整合到CV310的自主复制载体中，构建了pXY2-Cas9。2) 增强筛选压力：在供体DNA片段中直接嵌入潮霉素抗性筛选标记。3) 利用HDR增强型背景菌株：在CV310Δku70菌株中进行编辑效率测试。通过共转化靶向特定基因（如 *pox5*）的CRISPR质粒和相应的同源修复供体片段，转化子涂布于含相应抗生素的平板，挑取克隆并通过菌落PCR或测序验证编辑效率。研究详细记录了每种质粒组合在野生型和Δku70背景下的编辑效率和假阳性率。
第三步：开发并验证高效迭代编辑、多重编辑及多拷贝整合策略。 在优化系统基础上，研究者建立了更高效的“HDR-Cre/loxP”工作流程：仅使用带有loxP-flanked筛选标记的供体DNA片段（无需CRISPR质粒）直接转化CV310Δku70菌株，利用其高HDR效率实现基因敲入或替换，随后通过表达Cre重组酶回收标记。他们系统性地记录了单次编辑和完整迭代编辑（包括转化、筛选、验证、标记回收）所需的时间。
为实现多重编辑，研究者构建了含有双sgRNA表达盒的质粒pXY1-Cas9-sgRNA-plus，用于同时靶向 fat1 和 pox5 两个基因，并通过共转化相应的两个供体片段来评估双重编辑效率。
为评估多拷贝整合能力，研究者选择了核糖体DNA重复序列作为整合位点。构建了靶向18S rDNA位点的CRISPR质粒和带有筛选标记及 gfp 报告基因的供体片段。共转化后，随机挑取转化子，通过测量荧光强度（与单拷贝整合的对照菌株比较）初步评估整合拷贝数，并进一步采用定量PCR对选定的高荧光菌株进行精确的 gfp 基因拷贝数定量。
第四步：利用新建工具对Ena1-like蛋白G144进行功能表征。 这是应用新建工具解决生物学问题的范例。首先，进行 生物信息学分析：对G144进行氨基酸序列比对、系统发育树构建、跨膜结构域预测以及三维结构建模（使用AlphaFold3），并与已知的 C. viswanathii Ena1蛋白进行详细比较（包括结构叠合和均方根偏差计算）。
其次，进行 亚细胞定位分析：构建G144与GFP的融合蛋白表达载体，转化CV310，通过共聚焦激光扫描显微镜观察荧光信号在细胞中的分布，确定G144的亚细胞定位。
第三，进行 Na+转运活性分析：由于在CV310中直接进行转运蛋白功能验证较为复杂，研究者采用了异源表达策略。将密码子优化后的G144基因（G144*）克隆到酿酒酵母表达载体pYES2中，并转入Na+转运缺陷型酿酒酵母菌株AXT3K。通过商业化的酵母Na+转运检测试剂盒，以及在不同浓度NaCl（0 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM）的固体培养基上进行点板生长实验，观察菌株生长恢复情况，以判断G144是否具备Na+外排功能。同时设置了空载体和已知Na+/H+逆向转运蛋白SOS1作为阴性和阳性对照。
第四，探究 G144对DDA合成的影响：利用新建的编辑系统，分别构建了G144基因敲除菌株和在不同强启动子（PNCP1, *PFBA1*）驱动下的过表达菌株。在两种不同的碱性培养条件下进行摇瓶发酵：1) 反应培养基：使用Tris-HCl缓冲液维持pH 8.0，无外加Na+；2) 发酵培养基：通过定时添加NaOH维持pH 8.0，存在Na+压力。发酵结束后，通过高效液相色谱法测定DDA产量，并结合生物量（OD600）计算单位生物量的DDA产率，进行统计学差异分析。
主要结果 1. 内源元件与菌株特性： 启动子筛选显示 TDH1 启动子在CV310中驱动GFP表达的荧光强度最高，其次是 PGK1 和 *ENO1*。同源重组效率测定表明野生型CV310的HDR效率仅为约22%，属于NHEJ优势背景。敲除 ku70 后，HDR效率提升至79%，且菌株生长未受显著影响。
2. 编辑系统优化与比较： 线性CRISPR-geminin平台在CV310中实现了100%的 pox5 敲除效率，但受限于操作复杂性。未经优化的pCT-tRNA系统在CV310中完全无效（0%效率）。经过启动子优化和策略调整后，pXY1-Cas9系列质粒在CV310Δku70背景下的编辑效率得到极大提升。其中，关键结果是：在供体片段携带筛选标记的情况下，pXY1-Cas9-pox5与供体共转化实现了100%的编辑效率。更重要的是，仅使用供体片段（不含CRISPR质粒）转化CV310Δku70，编辑效率高达83-100%，这标志着极简且高效的“HDR-Cre/loxP”系统建立成功。
3. 编辑周期与高级操作能力： “HDR-Cre/loxP”系统将单基因编辑周期从传统方法的4-5天缩短至3天，将完整的迭代编辑（包含标记回收）周期从10天缩短至仅6天。在多重编辑方面，双sgRNA系统同时靶向 fat1 和 *pox5*，实现了最高25%的双靶点编辑效率，首次在 C. viswanathii 中验证了多重基因组编辑的可行性。在多拷贝整合方面，成功在18S rDNA位点整合了多达7个拷贝的 gfp 报告基因（通过荧光强度比较和qPCR验证），首次在 C. viswanathii 中实现了rDNA多拷贝整合。
4. G144蛋白功能解析结果： 生物信息学分析显示G144与 C. viswanathii Ena1蛋白有97%的序列相似性，但G144缺少一个跨膜螺旋，且在关键的阳离子转运ATP酶结构域存在30个氨基酸差异。结构叠合显示两者RMSD仅为0.689 Å，结构高度保守。亚细胞定位实验表明G144-GFP融合蛋白定位于细胞质膜。然而，Na+转运活性实验显示，表达G144* 的酿酒酵母AXT3K菌株并未恢复在含Na+平板上的生长能力，表明G144不具备功能性Na+外排活性。发酵实验结果显示：在无Na+的Tris-HCl缓冲系统中，G144敲除或过表达菌株的单位生物量DDA产量与对照菌株无显著差异；但在通过NaOH维持pH的系统中，无论是G144敲除还是过表达菌株，其单位生物量DDA产量均显著下降，而过表达并未导致生物量显著变化。
结论与意义 本研究成功开发了一套适用于 Candida viswanathii 的高效、可迭代的CRISPR/Cas9-Cre/loxP基因组编辑工具箱。该系统核心优势在于：1) 高效率：在优化条件下可达100%编辑效率；2) 快速迭代：完整编辑周期仅需6天；3) 多功能性：支持多重基因编辑和高达7拷贝的多拷贝基因整合；4) 操作简便：尤其“HDR-Cre/loxP”策略极大简化了工作流程。该工具包的建立，突破了 C. viswanathii 遗传操作的瓶颈，为其代谢工程和高效细胞工厂的构建提供了强大技术支撑，并可推广至其他 Candida 属酵母。
利用该工具，本研究首次对Ena1-like蛋白G144进行了深入功能表征。研究发现G144虽结构与Ena1高度相似并定位于质膜，但缺乏Na+转运活性。更重要的是，揭示了G144在DDA生物合成中的一个非典型、剂量敏感性的调控角色：其功能的丧失（敲除）或失衡（过表达）都会导致菌株在Na+/碱性pH胁迫条件下（即工业DDA生产的典型环境）的适应性下降，从而损害DDA的生产效率。而在无Na+胁迫条件下，这种影响消失。这提示G144可能作为一个膜相关调控因子，整合Na+/碱性pH胁迫信号并维持膜稳态，其表达水平需要精确调控以优化胁迫耐受性和产物合成之间的平衡。这一发现为理解 Candida 酵母在工业相关胁迫条件下的适应机制提供了新视角，也对通过精细调控相关基因表达来优化发酵过程具有指导意义。
研究亮点 1. 方法学创新：成功将经典的CRISPR/Cas9策略通过启动子优化、筛选策略改进和利用Δku70背景，适配于难操作的二倍体非传统酵母 *C. viswanathii*，并开发出更快捷的“仅用供体”编辑流程。 2. 性能卓越：实现了在该菌中此前未报道的快速迭代编辑（6天周期）、多重编辑（双靶点）和高拷贝整合（7拷贝）能力，工具性能全面。 3. 应用示范：并非止步于工具开发，而是立即运用新工具解决了一个具体的生物学问题——解析了G144蛋白在工业发酵相关胁迫响应中的独特功能，展示了工具的强大实用性。 4. 机制新见解：发现了G144这一与经典离子泵Ena1同源却功能迥异的蛋白，提出了其在胁迫响应中可能扮演的“剂量敏感型调控因子”新假设，超越了对其作为简单转运蛋白的预期，具有重要的科学启示价值。