这项研究由来自南京林业大学轻工与食品科学学院的甘涛（Tao Gan）、周恰（Qia Zhou）、苏晨（Chen Su）、谢迪（Di Xie）、刘祝兰（Zhulan Liu）和曹云峰（Yunfeng Cao），以及HMEI机械与工程公司的周恰、苏州经贸职业技术学院纺织服装与艺术传媒学院的夏建宇（Jianyu Xia）共同完成。其中，甘涛和周恰为共同第一作者，刘祝兰和曹云峰为通讯作者。该研究成果于2021年3月30日在线发表于爱思唯尔（Elsevier）旗下的学术期刊 International Journal of Biological Macromolecules。
本研究属于天然高分子化学与生物质精炼领域，其核心科学问题是木质素-碳水化合物复合体（lignin-carbohydrate complexes, LCC）的高效分离。LCC是木质纤维素生物质中，木质素与半纤维素通过共价键连接形成的复杂大分子结构，具有抗氧化、抗紫外线、抗病毒及生物相容性等多种生物活性，在生物医药领域展现出巨大的应用潜力。然而，传统的固-液提取法（solid-liquid extraction, SLE）在分离LCC时效率低下，主要原因在于两方面：一是木质纤维素自身复杂的超分子结构形成了天然的生物阻抗（innate bioimpedance），阻碍了提取溶剂的渗透；二是提取溶剂与固体物料之间存在巨大的传质阻力（mass transferring resistance），导致LCC难以从固相充分转移至液相。为了解决这一限制，该研究团队提出了一种创新的液-液提取（liquid-liquid extraction, LLE）策略，旨在通过消除固体物料的相态限制，实现LCC的高效分离，并系统探究此方法对LCC化学结构与抗氧化活性的影响。
为了验证LLE方法的优越性，研究者设计了一套清晰的对比实验流程。首先，他们以小麦秸秆（wheat stalk）为原料，经过粉碎、苯/乙醇脱脂和温和的球磨（ball-milling）预处理后，将原料分为两组进行LCC的分离。对照组采用传统的SLE方法，即经典的Björkman法。该方法直接使用75%的二氧六环水溶液（dioxane aqueous）对球磨后的固体秸秆进行提取，所得上清液经透析、浓缩后，溶解于90%乙酸水溶液并在去离子水中再生，获得富含木质素的LCC组分，命名为SL-LCC-AcOH；其残渣再用50%乙酸水溶液进行二次提取，提取液经浓缩、在二氯甲烷/乙醇中再生等多步纯化，获得富含碳水化合物的组分，命名为SL-LCC-Björkman。实验组则采用改良的LLE方法，其关键创新步骤是先将球磨后的固体秸秆溶解于8%的氯化锂/二甲基亚砜（LiCl/DMSO）溶剂体系中，形成均匀的液态溶液，从而完全消除了物料的固态生物阻抗。随后，将该溶液逐滴加入至5倍体积的75%二氧六环水溶液中进行再生和提取，重复三次获得上清液，再经过与对照组相似的乙酸纯化步骤，得到富含木质素的组分，命名为LL-LCC-AcOH。其再生后的残渣同样采用Björkman法进行后续提取，得到富含碳水化合物的组分LL-LCC-Björkman。在获得四种LCC样品后，研究者使用了一套全面的分析表征体系来揭示其结构与活性的构效关系。通过美国国家可再生能源实验室（NREL）的标准方法测定了LCC的化学组成；利用凝胶渗透色谱（GPC）分析了分子量；采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、紫外-可见光谱（UV-Vis）和液态核磁共振波谱（包括13C NMR、31P NMR和2D-HSQC NMR）详细解析了LCC的化学结构、官能团含量和主要连接键类型。最后，通过1,1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）清除实验、羟基自由基（OH•）清除实验和铁离子还原抗氧化能力（FRAP）测定这三种方法，系统评估了各LCC组分的抗氧化活性。
研究结果有力地证明了LLE方法的显著优势。首先，在产物得率与组成方面，LLE法的总LCC得率达到9.7%，明显高于SLE法的8.3%。其中，LLE法获得的富含木质素组分LL-LCC-AcOH的得率高达8.0%，而SLE法对应的SL-LCC-AcOH得率仅为0.4%。这直接证实了通过LiCl/DMSO溶解步骤消除固-液传质阻力后，大量在传统方法中难以提取的LCC片段，尤其是木质素含量高的部分，被有效释放并回收。相应地，LLE工艺前期提取效率高，导致后续残渣中剩余的LCC减少，使得LL-LCC-Björkman的得率（1.7%）低于SL-LCC-Björkman（7.9%）。化学组成分析显示，所有LCC组分中主要的糖单元均为木聚糖（xylan），且LCC-AcOH组分均为富含木质素的复合体，而LCC-Björkman则富含碳水化合物。其次，在分子结构层面，GPC结果显示所有LCC的分子量分布在17,000至22,000 g/mol之间，分布较窄（多分散性指数PI<1.6）。值得注意的是，LLE法获得的LCC分子量略低于SLE法，且2D-HSQC NMR谱图分析表明，LLE法得到的LCC中β-O-4芳基醚键含量有所降低，而紫丁香基（S）与愈创木基（G）单元的比值（S/G值）更高，酚羟基含量也更高。这归因于LiCl作为一种路易斯酸（Lewis acid），在溶解过程中催化了部分酸不稳定的醚键发生断裂，导致大分子轻度解释，并可能促进了富含S单元的次生壁组分释放。LCC连接键的定量分析显示，γ-酯键（γ-esters）是所有LCC中最主要的木质素-碳水化合物连接形式，LLE法提取的LL-LCC-AcOH中该键含量最高，达到每100个芳环单元9.76个，且苯基糖苷键含量也最为丰富。最后，这些结构特征直接影响了抗氧化活性。实验表明，所有LCC的自由基清除能力均呈剂量依赖效应。在同等浓度下，富含木质素的LCC-AcOH组分的抗氧化活性均显著强于富含碳水化合物的LCC-Björkman组分。最关键的是，在所有分离的组分中，通过LLE方法获得的LL-LCC-AcOH表现出了最强的抗氧化能力。在FRAP测定中，其在2.5 mg/mL浓度下的吸光度值达到1.44，远高于其他组分。
综合以上结果，研究者得出明确结论：通过引入LiCl/DMSO溶解步骤构建的液-液提取（LLE）方法，克服了传统固-液提取中的生物阻抗和传质阻力，不仅使LCC的总得率提高了17%，尤其是使富含木质素的活性LCC组分得率剧增了19倍，而且LiCl温和的路易斯酸催化作用，赋予了所得产物（LL-LCCs）更低的分子量、更高的酚羟基含量和更高的S/G值，这些结构特性共同促使其抗氧化活性优于传统方法提取的产物。该研究的价值在于，它不仅提供了一种高效制备高抗氧化活性LCC的创新技术路线，为木质纤维素生物质的高值化利用提供了新思路，而且深化了对LCC结构与抗氧化功能之间构效关系的科学理解。该方法的建立有望显著提升LCC在生物制药和功能性材料领域的应用潜力，使其作为天然自由基清除剂具有更广阔的前景。