该文档属于类型a，是一篇关于藜麦（quinoa）在激素处理和非生物胁迫下内参基因筛选的原创性研究论文。以下是针对该研究的学术报告：

一、研究作者与发表信息

本研究由Xiaolin Zhu（甘肃农业大学农学院）、Baoqiang Wang（甘肃农业大学生命科学技术学院）、Xian Wang（甘肃省干旱生境作物学重点实验室）和Xiaohong Wei（通讯作者，甘肃农业大学）共同完成，发表于Physiol Mol Biol Plants期刊（2021年11月）。

二、学术背景

研究领域与动机

研究领域为植物分子生物学，聚焦于实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）技术中内参基因（internal reference gene）的稳定性问题。qRT-PCR是基因表达分析的金标准，但其准确性依赖于内参基因的表达稳定性。然而，已有研究表明，内参基因的表达可能因组织类型或处理条件（如激素、胁迫）而异，直接使用未经筛选的内参基因会导致数据偏差。

藜麦（*Chenopodium quinoa*）是一种耐逆性强的作物，但其在非生物胁迫（如低温、盐胁迫）和激素（如脱落酸ABA）诱导下的分子机制研究较少，尤其是缺乏针对不同实验条件下的稳定内参基因筛选。因此，本研究旨在鉴定藜麦幼苗在ABA、低温和盐胁迫下的最优内参基因，为后续基因表达分析提供标准化工具。

科学问题与目标

核心问题：不同胁迫条件下藜麦内参基因的稳定性是否一致？
研究目标：
1. 评估9个候选内参基因（如*ACT-1*、*EF1α*、*GAPDH*等）在三种处理下的表达稳定性；
2. 通过多软件分析（GeNorm、NormFinder、BestKeeper）确定最优内参基因组合；
3. 验证筛选结果对目标基因（*PLIM2c*、*WLIM1*、*WLIM2b*）表达分析的影响。

三、研究流程与方法

1. 实验材料与处理

• 材料：藜麦品种“陇藜1号”（Longli No.1）幼苗，取第二真叶期的茎和叶。
  
• 处理条件：
  
  • 盐胁迫：200 mmol/L NaCl；
    
  • 低温胁迫：4℃；
    
  • ABA诱导：200 μmol/L ABA。
    
• 采样时间点：0、2、4、8、12小时，每个时间点混合15株样本，设3次生物学重复。
  

2. RNA提取与cDNA合成

• 使用MiniBEST Plant RNA提取试剂盒（Takara）提取总RNA，经DNase处理去除DNA污染。
  
• RNA质量检测：通过Nanophotometer-N60超微量分光光度计测定260/280 nm吸光度比值（1.8–2.2），并通过1%琼脂糖凝胶电泳验证完整性。
  
• cDNA合成：使用PrimeScript RT-PCR试剂盒，反转录后稀释至100 ng/μL备用。
  

3. 候选内参基因与引物设计

• 候选基因：9个常用内参基因（*ACT-1*、*EIF*、*EF1α*、*GAPDH*、*TUA*、*TUB-9*、*TUB-1*、*H2A*、*L8-1*），基于藜麦基因组序列设计特异性引物（表1）。
  
• 引物验证：通过PCR扩增和熔解曲线分析确认扩增产物单一性（100–200 bp，无二聚体）。
  

4. qRT-PCR与数据分析

• 反应体系：20 μL（含2 μL cDNA模板、SYBR Green预混液、引物），循环条件：95℃ 30秒预变性，40个循环（95℃ 5秒，60℃ 30秒）。
  
• 标准曲线：通过5倍梯度稀释cDNA（6个梯度）计算扩增效率（E = 2^−1/k −1，*k*为斜率）。
  
• 稳定性分析：
  
  • GeNorm：计算表达稳定性值（*M*），M <1.5为稳定；通过配对变异值（*V*）确定最优内参基因数量（*V*_n/n+1 <0.15时选择*n*个基因）。
    
  • NormFinder：基于方差分析的稳定性值（*S*），*S*越小越稳定。
    
  • BestKeeper：通过Ct值的标准差（*SD*）、变异系数（*CV*）和相关系数（*r*）评估稳定性（SD 为稳定）。
    

5. 验证实验

选择稳定性最高（*EF1α*、*TUB-1*、*L8-1*）和最不稳定（*GAPDH*、*ACT-1*）的内参基因，标准化目标基因（*PLIM2c*等）的表达量，对比不同内参基因对结果的影响。

四、主要结果

1. 候选基因表达水平差异

   • Ct值范围15.680–29.887，*TUB-9*表达量最高（Ct=18.763），*EF1α*最低（Ct=26.940）。
     
   • *GAPDH*和*TUB-1*的Ct值波动最大，提示表达不稳定。
     

2. 多软件稳定性排名

   • ABA处理：*EF1α*（M=0.45, S=0.45）和*EIF*最稳定；*GAPDH*（M=1.34）最不稳定。
     
   • 盐胁迫：*EF1α*（S=0.21）和*TUB-1*（SD=0.963）最稳定。
     
   • 低温胁迫：*L8-1*（S=0.27）和*EF1α*最稳定。
     
   • GeNorm分析显示需2个内参基因组合（V_²⁄3 <0.15）。
     

3. 验证实验

   • 使用稳定内参基因（如*EF1α*）时，目标基因表达趋势一致；而使用*GAPDH*时，表达量偏差显著（如低温下目标基因表达量高估30倍）。
     

五、结论与意义

1. 结论：

   • *EF1α*在三种处理下均表现稳定，适合作为藜麦胁迫研究的通用内参基因；
     
   • *GAPDH*稳定性最差，不推荐使用；
     
   • 建议结合*EF1α*与*EIF*或*L8-1*以提高数据可靠性。
     

2. 科学价值：

   • 首次系统评估藜麦在非生物胁迫和激素诱导下的内参基因稳定性；
     
   • 为藜麦逆境分子机制研究提供了标准化工具。
     

3. 应用价值：

   • 避免因内参基因选择不当导致的基因表达分析误差；
     
   • 可推广至其他作物内参基因筛选。
     

六、研究亮点

1. 多维度分析：结合GeNorm、NormFinder、BestKeeper三种算法，结果更可靠；
   
2. 验证严谨性：通过目标基因表达对比，直接证明内参基因选择对结果的影响；
   
3. 填补空白：首次针对藜麦胁迫条件建立内参基因筛选体系。
   

七、其他价值

• 实验设计涵盖时间动态（0–12小时）和组织类型（茎、叶），增强了结果的普适性；
  
• 提供的引物序列和分析方法可为后续研究直接引用。