CRISPR干扰引导的甲羟戊酸途径平衡增强萜类化合物生产
作者及机构
本研究由韩国生物科学与生物技术研究所（KRIBB）合成生物学与生物工程研究中心的Seong Keun Kim、Gui Hwan Han、Wonjae Seong等团队完成，合作单位包括韩国科学技术院（UST）和庆尚国立大学。研究成果发表于2016年8月的Metabolic Engineering期刊（卷38，页228-240）。
学术背景
研究领域：代谢工程与合成生物学。
科学问题：萜类化合物（terpenoids）是广泛应用于医药、香料及生物燃料的重要天然产物，但其微生物合成常因代谢途径不平衡导致产量受限。具体表现为：
1. 代谢负担：异源表达多基因途径（如甲羟戊酸途径，MVA pathway）可能积累毒性中间体（如HMG-CoA和IPP），抑制宿主生长。
2. 调控工具不足：传统基因敲除方法不可逆，且难以动态平衡多基因表达。
研究目标：开发基于CRISPR干扰（CRISPRi）的可调控系统，通过精确抑制MVA途径关键基因，优化碳流向萜类合成，提升产物产量并缓解生长抑制。
研究流程与方法
1. CRISPRi系统构建与验证
- 载体设计：构建低拷贝质粒pSECRI，包含：
- dCas9基因：由L-鼠李糖诱导型启动子（rhaPBAD）调控。
- sgRNA模块：靶向目标基因的5’UTR或编码区，由组成型启动子J23119驱动。
- 功能验证：
- 单/双靶点抑制：靶向大肠杆菌BL21(DE3)的T7 RNA聚合酶（T7RNAP）和报告基因GFP，证实双靶点抑制效率更高（27倍 vs 单靶点3.9倍）。
- 流式细胞术：验证CRISPRi的剂量依赖性抑制（L-鼠李糖浓度0–1 mM）。
2. MVA途径基因调控
- 靶点设计：针对MVA途径的7个酶设计sgRNA，分两类：
- 启动子区靶点（K1-K3）：抑制整个操纵子转录。
- 基因内部靶点（E1-E4）：特异性抑制乙酰乙酰-CoA硫解酶（MvaE，途径第一步酶）。
- 报告系统验证：
- 基因报告实验：sgRNA结合荧光报告质粒（pregfp3），证实MvaE抑制效率最高（96.7%）。
- 操纵子报告实验：替换MVA途径中MvaD或MvaS为sfGFP，发现内部启动子活性影响抑制效果。
3. 萜类生产优化
- 菌株与质粒：
- 底盘细胞：大肠杆菌DH5α（生产番茄红素）和BL21(DE3)（生产异戊二烯和α-红没药醇）。
- 生产质粒：ptm-crt（番茄红素）、ptm-isp（异戊二烯）、ptm-bbs（α-红没药醇）。
- 动态调控策略：
- 种子期抑制：添加1 mM L-鼠李糖抑制MvaE，减少毒性中间体积累。
- 生产期释放：稀释L-鼠李糖恢复基因表达，提升产物合成。
- 关键结果：
- 番茄红素：MvaE抑制使产量提升8倍（71.4 mg/L vs 对照组8.9 mg/L）。
- α-红没药醇：产量增加10.6倍。
- 异戊二烯：通过抑制内源基因IspA（法尼基二磷酸合酶），平衡IPP/DMAPP分配，产量提升2.6倍。
4. 生长与代谢平衡
- IspA调控：CRISPRi抑制IspA使细胞生长率降低80%，但引入MVA途径后恢复至95%，证明代谢流重定向至产物合成。
主要结果与逻辑链条
- CRISPRi高效性：双靶点抑制比单靶点更有效，为多基因调控奠定基础。
- MvaE的关键作用：其抑制显著提升萜类产量，证实首步酶是代谢瓶颈。
- 动态调控优势：种子期抑制毒性基因，生产期释放表达，兼顾生长与产量。
- 内源基因调控：IspA抑制证明CRISPRi可协调必需基因与异源途径的冲突。
结论与价值
科学意义：
- 提出CRISPRi作为代谢途径动态平衡的通用工具，克服传统敲除的不可逆性。
- 揭示MVA途径中MvaE是调控关键，为萜类工程提供新靶点。
应用价值：
- 可推广至其他高价值化合物（如聚羟基脂肪酸酯、黄酮类）的微生物生产。
- 为构建“智能细胞工厂”提供模块化调控平台。
研究亮点
- 方法创新：首次将CRISPRi应用于萜类途径的动态调控，实现“一键式”多基因抑制。
- 工程策略：结合启动子与基因内部靶点，精准控制操纵子表达。
- 跨物种适用性：质粒设计兼容多种细菌宿主（如pSEVA系列）。
其他价值
- 质粒稳定性：CRISPRi调控显著提高生产质粒的维持率（100% vs 未调控4.7%）。
- 毒性缓解：通过抑制MvaE，解决了IPP/DMAPP积累导致的生长抑制问题。
（注：全文术语首次出现时标注英文，如CRISPR干扰（CRISPR interference）、甲羟戊酸途径（MVA pathway）等。）