本研究由内蒙古农业大学草业学院的陈琦、张艳、戴睿、霍晓伟、李振毅、高翠萍、石凤翎、张志强，以及内蒙古农牧业科学院的义凤艳共同完成。研究成果以题为“Overexpression of the alfalfa gene MsTIFY10A confers thrips resistance in Medicago truncatula”的论文形式，于2025年10月24日在线发表于学术期刊《Environmental and Experimental Botany》（环境与实验植物学）的第239卷，文章编号为106260。该论文是一项关于植物抗虫性的原创性研究。
本研究所属的科学领域为植物分子生物学与植物保护学的交叉领域，聚焦于植物如何通过遗传和分子机制抵御害虫。研究背景在于，苜蓿作为一种全球广泛种植的重要多年生豆科牧草，其产量和品质常受害虫严重威胁，其中蓟马（Thrips）是危害最重的害虫之一。蓟马属于吸食细胞内容的昆虫，与常见的取食韧皮部或咀嚼叶片的害虫不同，植物对其的防御策略研究相对薄弱。据统计，蓟马可导致苜蓿干草减产10%-30%，严重时鲜草产量损失可达50%，造成巨大经济损失。因此，挖掘和解析苜蓿自身的抗蓟马基因及其作用机制，对于培育抗虫新品种、实现绿色防控具有重要的理论和应用价值。TIFY转录因子家族是植物特有的一类蛋白，广泛参与植物发育、非生物胁迫及生物胁迫响应。前期研究中，研究者通过对两个抗蓟马能力不同的苜蓿品种（抗性品种‘草原4号’和感虫品种‘草原2号’）进行转录组比较分析，发现TIFY10A基因在抗性品种中表达更高，可能参与茉莉酸（JA）介导的抗蓟马过程。基于此背景，本研究旨在克隆‘草原4号’苜蓿中的MsTIFY10A基因，并通过在模式植物蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中过表达，系统评估该基因在抗蓟马中的功能，揭示其调控网络和作用机制，为解析苜蓿抗虫分子机制提供理论框架。
本研究的工作流程复杂而系统，共包含五个主要阶段。第一阶段是目标基因的克隆与生物信息学分析。研究团队首先从45天苗龄的‘草原4号’和‘草原2号’苜蓿叶片中提取总RNA并逆转录为cDNA。使用针对MsTIFY10A开放阅读框（ORF）的特异性引物进行PCR扩增，成功克隆了该基因。随后进行生物信息学分析：利用NCBI ORF Finder确定其ORF长度为537 bp，编码178个氨基酸；通过ProtParam工具分析其理化性质；利用NCBI保守结构域搜索和Blast进行同源序列比对，发现其与蒺藜苜蓿的MtTIFY10A相似度高达94.86%；采用MEGA 5.0软件构建系统进化树，显示其与蒺藜苜蓿、黧豆等物种的TIFY10A亲缘关系最近。同时，通过qRT-PCR技术检测了该基因在不同组织（根、茎、老叶、嫩叶、花、荚果、种子）中的表达模式，以及受蓟马取食诱导后的表达变化。
第二阶段是基因功能的初步鉴定，包括亚细胞定位和转录自激活活性检测。为了明确MsTIFY10A蛋白在细胞中的位置，研究者构建了35S启动子驱动的MsTIFY10A-GFP（绿色荧光蛋白）融合表达载体，通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的瞬时转化法侵染本氏烟草叶片。培养48小时后，使用奥林巴斯FV10-ASW共聚焦显微镜观察，结果显示GFP荧光信号只存在于细胞核中，证实MsTIFY10A是一个核定位蛋白。为了检测其是否具有自主激活转录的能力，研究将MsTIFY10A的编码序列克隆到酵母双杂交系统的pGBKT7（BD，DNA结合结构域）诱饵载体中，转化Y2HGold酵母菌株。转化子首先在缺乏色氨酸（SD/-Trp）的培养基上生长以验证载体转入，然后点板到添加了X-α-Gal和Aureobasidin A（AbA）的SD/-Trp/X-α-Gal/AbA选择培养基上。结果显示，含有BD-MsTIFY10A的酵母菌无法在该选择培养基上生长和显色，而阳性对照可以，这表明MsTIFY10A蛋白本身不具备转录激活活性。
第三阶段是转基因材料的创制与抗虫表型鉴定。这是研究的核心环节之一。首先，将MsTIFY10A的ORF通过Gateway技术重组到含有CaMV 35S强启动子和Bar（抗草铵膦）筛选标记的pEarleyGate 100载体中，构建了过表达载体。通过农杆菌介导的叶盘共培养法，转化蒺藜苜蓿基因型R108，获得T0代转化苗。经过草铵膦抗性试纸条初筛和PCR检测验证，筛选出两个转基因阳性株系，命名为OE-1和OE-2，并进一步繁殖获得纯合的F1代种子用于后续实验。qRT-PCR确认这两个株系中MsTIFY10A的表达量分别比野生型（WT）高约2.7倍和2000倍。抗虫表型分析严格进行：将40天苗龄的WT、OE-1和OE-2植株进行蓟马接种处理（每盆100头成虫），并在接种后0、3、7、14天取样观察。通过直接计数法统计叶片上的成虫数量，通过台盼蓝染色法（一种可特异性染色昆虫产卵痕的方法）在体视显微镜下统计产卵点数量。此外，为了探究可能的物理防御机制，研究使用扫描电子显微镜（SEM）观察并测量了叶片表皮毛（Trichomes）的密度和长度。
第四阶段是生理生化指标测定。在蓟马取食的不同时间点（0、3、7、14天），研究者测定了转基因和野生型植株叶片中一系列与抗逆和防御相关的生理指标。这包括六种抗氧化/防御酶的活性：超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和脂氧合酶（LOX）。同时，测定了两种重要防御性次级代谢产物的含量：总黄酮和总酚。此外，还分析了可溶性糖和可溶性蛋白的含量变化。所有测定均使用北京索莱宝科技有限公司的试剂盒，严格按照说明书操作，每个处理设置三个生物学重复。
第五阶段是多组学联合分析与机制深入挖掘。为了在分子层面揭示MsTIFY10A调控抗蓟马的网络，研究对生长54天的WT、OE-1和OE-2植株叶片进行了转录组和代谢组学分析。转录组测序委托上海美吉生物医药科技有限公司完成，每个基因型三个生物学重复。获得高质量序列（clean reads）后，使用StringTie进行转录本组装，通过RSEM进行基因表达量（TPM值）量化，利用DESeq2软件以FDR<0.05且|log2FC|≥1为标准筛选差异表达基因（DEGs）。将DEGs比对到GO和KEGG数据库进行功能富集分析。代谢组学分析同样使用六个生物学重复，采用基于质谱的非靶向代谢组学技术，通过主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）评估组间差异，以p值<0.05和变量重要性投影（VIP）>1为标准筛选差异积累代谢物（DAMs）。最后，整合转录组和代谢组数据，将DEGs和DAMs共同映射到KEGG通路，并选取关键通路中的关键基因进行qRT-PCR验证，构建MsTIFY10A调控抗蓟马的分子模型。
研究取得了系统而丰富的结果。在基因特性方面，确认MsTIFY10A主要在嫩叶中高表达，且能被蓟马取食显著诱导。该蛋白定位于细胞核，但不具备自主转录激活能力。在抗虫表型方面，尽管在蓟马取食早期（3、7天），过表达株系（OEs）与野生型（WT）在虫口数量和产卵量上无显著差异，但在取食14天后，OEs上的成虫数量和产卵点均显著低于WT（p<0.05）。这表明MsTIFY10A的过表达确实增强了植株对蓟马的抗性，这种抗性表现为对害虫种群发展的持续抑制。物理防御方面，SEM观察显示，OEs叶片上的表皮毛密度和长度均显著高于WT，其中直立表皮毛长度增加了约1.58倍，密度增加了约3倍。这为抗虫性提供了重要的物理屏障解释。
生理生化结果显示，在未受胁迫时（0天），OEs的POD、CAT、PPO和LOX活性已高于WT。在14天蓟马取食后，所有测定的六种防御酶（SOD、POD、CAT、PPO、PAL、LOX）活性在OEs中均显著高于WT。次级代谢物方面，无论胁迫前后，OEs中的总黄酮和总酚含量均持续显著高于WT。可溶性糖含量在OEs中始终较低，而可溶性蛋白含量在胁迫早期较高，后期降低。这些数据表明，MsTIFY10A过表达组成性地或诱导性地增强了植株的抗氧化系统和防御性次级代谢物的合成能力，这是其生理防御基础。
多组学分析结果提供了更深入的机制洞察。转录组分析发现，在OE1与WT、OE2与WT的比较中，分别鉴定出412个和893个DEGs。两个过表达株系共有的差异基因（co-DEGs）有128个。KEGG富集分析显示，这些DEGs显著富集于类黄酮生物合成、异黄酮生物合成、植物激素信号转导、MAPK信号通路、角质/软木/蜡质生物合成等通路。代谢组学分析鉴定出大量DAMs，并在过表达株系中富集到类黄酮生物合成、苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸生物合成、α-亚麻酸代谢等通路。至关重要的联合分析发现，转录组和代谢组数据在类黄酮生物合成、异黄酮生物合成和苯丙烷生物合成通路上存在协同富集。深入剖析这些通路发现，OEs中苯丙烷生物合成途径的限速酶基因（如PAL、4CL）表达上调，导致下游代谢物如查尔酮等积累增加。在类黄酮/异黄酮分支上，查尔酮异构酶（CHI）、异黄酮合酶（IFS）、异黄酮2‘-羟化酶（I2’H）等关键基因在OE2中显著上调，驱动了染料木素、鹰嘴豆素A、芒柄花素、豌豆素等多种异黄酮类物质的积累。同时，植物激素信号通路分析表明，JA信号通路中的JAZ基因表达被抑制，而SA信号通路中的PR1基因表达被激活，内源JA和SA水平也发生变化，暗示了JA/SA信号的协同作用。此外，萜类骨架生物合成途径的MEP通路关键基因DXS表达上调，以及谷胱甘肽代谢、亚油酸代谢相关基因（如GST、LOX1_5、LOX2s）的表达变化，共同构成了一个复杂的防御调控网络。这些分子层面的变化与前述的生理生化表型（如酶活性提高、黄酮积累）和最终的抗虫表型形成了完整的证据链。
本研究的结论是：从‘草原4号’苜蓿中克隆的转录因子MsTIFY10A，是一个定位于细胞核、无自主转录活性的TIFY家族蛋白。其在蒺藜苜蓿中过表达，能通过多种机制显著增强对蓟马的抗性。这些机制包括：1）增强物理防御，即增加叶片表皮毛的密度和长度，形成物理屏障；2）强化生理生化防御系统，即提高多种抗氧化酶活性和防御性次级代谢物（黄酮、酚类）的含量；3）调控复杂的分子网络，通过激活苯丙烷/类黄酮/异黄酮生物合成途径、协调JA/SA激素信号转导、以及影响萜类代谢和脂氧合酶途径等多个通路，系统性重塑植株的防御状态。本研究的意义和价值在于：在科学上，首次详细解析了一个苜蓿TIFY转录因子在抗细胞内容式害虫（蓟马）中的功能与作用机制，填补了该领域的研究空白，为理解植物对这类特殊害虫的防御策略提供了新的分子视角和关键基因资源。在应用上，MsTIFY10A基因可作为重要的候选基因，用于通过分子育种或基因工程技术培育抗蓟马的苜蓿乃至其他作物新品种，为减少农药使用、发展可持续农业提供新的解决方案。
本研究的亮点突出。首先，在研究对象上，聚焦于危害严重但研究相对薄弱的吸食细胞内容害虫——蓟马，以及重要的牧草作物苜蓿，具有明确的产业问题导向。其次，在研究策略上，采用了从抗/感品种比较转录组学中挖掘候选基因，到基因克隆与功能验证，再到生理表型、转录组、代谢组多层次联合分析的完整技术路线，逻辑严谨，证据充分。特别是整合了转录组和代谢组学数据，不仅验证了生理层面的发现，更在通路水平上揭示了MsTIFY10A调控的复杂网络，将基因功能与具体的代谢物变化和防御通路直接关联，深度阐明了其作用机制。再者，研究发现MsTIFY10A虽然无转录自激活能力，但可能通过抑制JAZ蛋白等方式间接调控下游广泛的防御反应，这为理解TIFY家族蛋白的非经典功能提供了新线索。最后，研究构建了从分子到生理再到整体抗虫表型的完整证据链，结论可靠，为后续研究奠定了坚实基础。
此外，研究中还有一些有价值的细节。例如，发现两个过表达株系OE1和OE2的抗性程度和基因表达调控幅度存在差异（OE2远强于OE1），这与它们MsTIFY10A表达量的巨大差异（2000倍 vs 2.7倍）相吻合，提示抗性强度可能与基因表达水平呈正相关，为基因工程应用中的表达量调控提供了参考。再如，研究不仅关注了化学防御（酶和代谢物），也定量证实了物理防御（表皮毛）的增强，体现了对植物综合防御策略的全面考量。这些细节共同支撑起一项系统、深入且具有重要价值的植物抗虫分子生物学研究。