本研究由浙江工业大学生物技术与生物工程学院及生物转化与生物纯化教育部工程研究中心的沈奇（Qi Shen）、于壮（Zhuang Yu）、周晓婷（Xiao-Ting Zhou）、张世佳（Shi-Jia Zhang）、邹树平（Shu-Ping Zou）、熊能（Neng Xiong）、薛亚平（Ya-Ping Xue）、刘志强（Zhi-Qiang Liu）和郑裕国（Yu-Guo Zheng）等人共同完成，通讯作者为刘志强。该研究于2021年4月5日在线发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》期刊，卷号为105，页码3211–3223。
本研究属于生物技术与微生物学领域，聚焦于毕赤酵母（Pichia pastoris）重组蛋白表达系统中抗生素抗性基因启动子的优化。毕赤酵母是仅次于大肠杆菌的第二大重组表达系统，其高效表达异源蛋白的常规策略包括使用强效的甲醇调控型醇氧化酶1启动子（paox1）以及增加表达盒的拷贝数。为了筛选含有多拷贝整合的转化子，通常将抗生素抗性基因（如来自Streptoalloteichus hindustanus的博来霉素抗性基因sh ble）构建到表达载体中，因为载体上抗生素抗性基因插入拷贝数越高，转化子对抗生素的耐受浓度也越高。然而，这些抗生素抗性基因通常由强组成型翻译延伸因子1α启动子（ptef1）驱动。在异源蛋白表达阶段，抗生素抗性蛋白并非必需，其持续表达会增加细胞代谢负担，尤其对于高拷贝菌株更为明显。此外，由于ptef1的高效表达，筛选多拷贝插入时需要使用高浓度且昂贵的抗生素。针对这些局限，本研究旨在寻找一种在葡萄糖（筛选阶段常用碳源）下具有适当活性、而在甘油和甲醇（重组蛋白生产阶段常用碳源）下活性较低的启动子来驱动抗生素抗性基因，从而降低抗生素使用成本并减少代谢负担。
研究流程可分为以下主要步骤。首先，研究者重新分析了毕赤酵母GS115菌株在不同碳源（葡萄糖、甘油、甲醇）下的RNA-seq数据，计算每个基因在葡萄糖条件下相对于甘油和甲醇的表达倍数。在5040个分析基因中，分别有1.6%和4.2%的基因在葡萄糖下的转录水平比甘油和甲醇高4倍以上，其中25个基因在甘油和甲醇条件下均表现低转录。考虑到驱动sh ble基因需要适中的启动子强度，研究者选择了在葡萄糖条件下RPKM值介于10³至10⁴之间的10个基因，并选取其中6个基因的上游1000 bp片段作为候选启动子（ppfk2、p768、p181、p642、p090、pdog2p1000），分别与绿色荧光蛋白变体（gfpuv）报告基因融合，构建报告质粒并转化毕赤酵母，通过测定不同碳源下的相对荧光单位来评估启动子活性和调控特性。结果显示，pdog2p1000和ppfk2在葡萄糖下活性弱于ptef1，且在甘油和甲醇下进一步下调，符合预期。随后，研究者将pdog2p1000和ppfk2分别替换ppiczαb载体中的ptef1，驱动sh ble基因表达。在含100 μg/ml博来霉素（zeocin）的平板上，ppiczαb、ppdog2p1000-ble和pppfk2-ble转化后分别形成约1500、20和200个菌落；对每种质粒挑取6个单克隆进行sh ble基因拷贝数分析，结果显示pdog2p1000-ble转化子的平均拷贝数为3.6，而pppfk2-ble为1.5。由于pdog2p1000驱动的sh ble基因拷贝数与zeocin抗性呈正相关，pdog2p1000被选为进一步研究的对象。接下来，研究者对pdog2p1000启动子进行截短分析，构建了pdog2p700、pdog2p500、pdog2p400和pdog2p300驱动gfpuv的报告质粒。结果显示不同长度截短体在不同碳源下的相对荧光单位非常接近，表明300 bp的上游片段已足以启动转录。进一步构建了pdog2p700-ble和pdog2p300-ble表达载体，转化后菌落数相似，且pdog2p300-ble菌株在YPD培养基中的sh ble转录水平仍比BMGY和BMMY培养基高约3倍。此后，研究者构建了带有6×组氨酸标签的ppiczαb-ble-his和ppdog2p300-ble-his载体，以便通过免疫印迹检测sh ble蛋白水平。转化后，ppiczαb-ble-his需铺于800 μg/ml zeocin平板才能获得少量菌落，其4个菌落的平均sh ble拷贝数为3.4；而ppdog2p300-ble-his仅需100 μg/ml zeocin即可筛选出相似拷贝数的高拷贝菌株。免疫印迹结果表明，pdog2p300-ble-his转化获得的高拷贝菌株中sh ble蛋白水平显著低于ppiczαb-ble-his转化子。为了验证pdog2p300作为表达载体的实用性，研究者将gfpuv基因插入paox1之后，构建了ppicz-gfpuv和ppdog2p300-ble-gfpuv载体。在100 μg/ml zeocin平板上筛选后，pdog2p300-ble-gfpuv转化子的相对荧光单位和gfpuv基因拷贝数分别比ppicz-gfpuv高6.5倍和3.2倍。同时，在BMGY和BMMY培养基中，pdog2p300-ble-gfpuv转化子的sh ble mRNA水平更低。研究者还测试了pdog2p300同时驱动两个抗生素抗性基因的可行性，构建了ppdog2p300-kan-mcherry载体，并将gfpuv和sh ble基因分别替换为mcherry和卡那霉素抗性基因。该载体转化GS115及已有gfpuv表达的gfp菌株后，在含1.0 mg/ml遗传霉素（geneticin）的平板上成功筛选到多拷贝卡那霉素抗性基因菌株，且同时检测到gfpuv和mcherry荧光信号。最后，研究者以胰岛素前体（insulin precursor, ip）为模式蛋白，构建了ppiczα-ip和ppdog2p300-ble-ip载体。转化后在100 μg/ml zeocin平板上筛选，pdog2p300-ble-ip转化子的ip基因拷贝数比ppiczα-ip高3.3倍，且培养上清中ip表达水平显著更高。RT-PCR证实，pdog2p300-ble-ip菌株在BMGY和BMMY中sh ble转录水平低于YPD。
研究结果表明，pdog2p300是一个新型的葡萄糖调控型启动子。在葡萄糖条件下，pdog2p300具有足够的转录活性以驱动sh ble基因表达，从而赋予转化子zeocin抗性用于筛选；而在甘油和甲醇条件下，该启动子活性显著降低，从而在paox1介导的重组蛋白生产阶段减少了抗生素抗性蛋白的表达，降低了细胞的代谢负担。通过使用pdog2p300驱动抗生素抗性基因，研究者能在仅含100 μg/ml zeocin的平板上筛选到拷贝数超过3的高拷贝菌株，而使用ptef1则需要800 μg/ml zeocin才能获得相似拷贝数的菌株。在pdog2p300-ble-his转化获得的高拷贝菌株中，sh ble蛋白水平几乎检测不到，进一步证实了降低代谢负担的效果。在gfpuv和ip的表达实验中，pdog2p300-ble载体转化的菌株不仅拷贝数更高，而且目标蛋白表达水平也显著提高，说明该策略在提高筛选效率的同时并未损害重组蛋白的生产能力，反而由于代谢负担的减轻可能有助于提高产量。
本研究的结论是：pdog2p300是一种适合驱动毕赤酵母中抗生素抗性基因的新型启动子，其在筛选阶段具有足够活性，而在重组蛋白表达阶段被抑制，从而实现对高拷贝菌株的低成本筛选并减少代谢负担。这一发现为毕赤酵母表达系统的载体优化提供了新的工具，具有明确的科学价值和应用前景。科学价值在于通过转录组数据挖掘和启动子工程，拓展了毕赤酵母可用启动子库，尤其是对葡萄糖调控型启动子的鉴定和表征，为后续碳源依赖性基因表达调控研究提供了参考。应用价值在于该策略可直接用于商业表达载体的改进，降低高拷贝菌株筛选过程中昂贵抗生素的用量，并减少抗生素抗性蛋白对生产菌株的代谢压力，从而提高重组蛋白的生产效率。此外，pdog2p300还可能用于驱动其他仅在特定阶段需要的基因，如CRISPR/Cas9基因组编辑工具的表达，为毕赤酵母的代谢工程和合成生物学研究提供新的调控元件。
本研究的亮点包括：首次报道了pdog2p300作为葡萄糖调控启动子驱动抗生素抗性基因的可行性；该启动子仅需300 bp即可发挥完整功能，有利于载体小型化；通过pdog2p300替换ptef1，显著降低了高拷贝菌株筛选所需的zeocin浓度（从800 μg/ml降至100 μg/ml）；在表达阶段sh ble蛋白几乎不表达，降低了代谢负担；gfpuv和ip实验均证明该策略可提高目标蛋白表达水平。研究还系统比较了pdog2p1000、pdog2p300及其截短体的活性，并通过免疫印迹和RT-PCR提供了可靠的分子证据。值得注意的是，pdog2p300在甘油和甲醇条件下仍保留约30%的活性，提示未来可通过合成生物学手段进一步改造其调控元件以实现更严格的葡萄糖依赖性表达，这为后续研究指明了方向。