本研究由东京工业大学化学资源实验室的Noriyo Mitome、Sakurako Ono、Toshiharu Suzuki、Katsuya Shimabukuro、Eiro Muneyuki和Masasuke Yoshida等人完成，发表于《European Journal of Biochemistry》（Eur. J. Biochem.）2002年第269卷第1期，页码为53–60。研究的核心问题是无机磷酸盐（Pi）如何抑制F1-ATPase中MgADP抑制态的形成，并探讨Pi在催化位点的作用机制。

F1-ATPase是F₀F₁-ATP合酶的催化部分，负责利用质子跨膜电化学梯度合成ATP，也可在体外催化ATP水解。F1由α₃β₃γδε亚基组成，其中三个催化位点位于β亚基上，三个非催化位点位于α亚基上。在ATP水解过程中，F₀F₁-ATP合酶容易捕获MgADP，从而形成所谓的MgADP抑制态。该抑制态被认为是由单个催化位点被MgADP占据所引起，而在催化循环中，两个催化位点同时被占据则会促进该抑制态的形成。此前的研究已经表明，Pi能够激活处于MgADP抑制态的F1-ATPase，并使其恢复持续的ATP水解活性，但Pi阻止MgADP抑制态形成的分子机制尚不清楚。该研究的目的正是阐明Pi在催化位点上的作用方式，以及Pi结合与核苷酸结合之间的关系。

为了实时监测核苷酸与催化位点的结合，研究者构建了一种突变型α₃β₃γ亚复合物，即α(W463F)₃β(Y341W)₃γ。该突变体将β亚基催化位点附近的酪氨酸残基Y341替换为色氨酸，通过色氨酸荧光猝灭来反映核苷酸的结合；同时将α亚基的W463替换为苯丙氨酸，以降低背景荧光。此外，为了排除ATP水解对实验结果解释的干扰，研究者还构建了另一种突变体α(W463F)₃β(E190Q/Y341W)₃γ，该突变体能够结合MgATP但不能水解ATP。实验中使用的F1-ATPase来自嗜热芽孢杆菌PS3。实验前，酶经过核苷酸耗竭处理，使每个酶分子所含腺嘌呤核苷酸少于0.05 mol。研究采用了ATP水解活性测定和荧光测量两种主要方法。ATP水解活性通过ATP再生系统测定NADH在340 nm处吸光度的下降来监测。荧光测量在25 °C下进行，激发波长为295 nm，发射波长为345 nm。在含有高浓度Pi的实验中，为了避免Pi与Mg²⁺络合导致游离MgADP浓度下降，研究者根据Clark等人的方法计算并调整了总Mg²⁺浓度。

第一部分的实验检测了α(W463F)₃β(Y341W)₃γ亚复合物在与MgADP预孵育后的ATPase活性变化。结果显示，当MgADP与该亚复合物的摩尔比达到1.5:1时，ATPase活性几乎被完全抑制，表明该突变体与野生型α₃β₃γ复合物一样能够形成MgADP抑制态。第二部分的实验考察了Pi对MgADP抑制态形成的影响。将α(W463F)₃β(Y341W)₃γ亚复合物与化学计量浓度的MgADP及不同浓度的磷酸钾预孵育5分钟后测定残留ATPase活性。结果表明，随着Pi浓度增加，MgADP抑制态的形成被显著抑制。Pi的半最大保护浓度为21±6.4 mM，最大保护程度约为未抑制活性的69%。当Pi浓度维持在20 mM时，改变MgADP与酶的比例，MgADP抑制程度也相应降低。这些结果证明Pi能够阻止MgADP抑制态的形成。第三部分实验利用荧光猝灭技术，直接监测Pi存在下MgADP与催化位点的结合情况。结果显示，尽管Pi浓度的升高使MgADP的结合速率略有减慢，但荧光猝灭的幅度几乎不受影响，在Pi保护作用最显著的浓度范围内，MgADP仍然能够结合到催化位点上。这一结果提示，Pi并不是通过阻止MgADP结合来抑制MgADP抑制态的形成。

第四部分实验进一步考察了Pi对MgATP结合的影响。由于使用可水解ATP的α(W463F)₃β(Y341W)₃γ复合物时，ATP在实验过程中可能被水解为ADP，结果不够清晰，因此研究者采用不能水解ATP的α(W463F)₃β(E190Q/Y341W)₃γ复合物进行实验。结果显示，Pi浓度越高，MgATP与催化位点的结合越慢。通过双指数函数拟合时间过程，得到两个时间常数，其中慢时间常数随Pi浓度的增加而明显延长。对慢时间常数进行米氏方程拟合，估算出Pi的表观亲和力为19±3.6 mM，与Pi抑制MgADP抑制态形成的半最大浓度21 mM非常接近。而Pi对MgADP结合的时间常数和荧光猝灭幅度几乎无影响。这些结果表明，Pi结合在催化位点上，与MgATP竞争结合，但基本上不干扰MgADP的结合。Pi可能占据ATP的γ-磷酸位置，因此与ADP的结合不发生直接竞争。

第五部分实验对α(W463F)₃β(E190Q/Y341W)₃γ复合物进行了MgATP浓度滴定实验。结果显示，在无Pi条件下，MgATP结合较快；在10 mM磷酸盐存在下，MgATP结合明显变慢，且在0.2 μM ATP浓度附近结合最慢。当MgATP浓度低于0.1 μM或高于1 μM时，结合速率相对较快。这表明Pi对MgATP结合的干扰主要在双位点条件下最为显著，即MgATP结合到第二个催化位点时受Pi影响最大。单一位点（uni-site）的ATP结合似乎不受Pi的显著影响。与此一致的是，α(W463F)₃β(Y341W)₃γ复合物在20 mM Pi存在下，其初始ATPase活性在0.3、1和10 μM ATP浓度下分别被抑制了29%、48%和13%，而在100 μM ATP浓度下无明显抑制。

综合以上实验结果，该研究提出了Pi抑制MgADP抑制态形成的机制：Pi结合在催化位点上，但并不将MgADP从催化位点上排出，而是与MgADP同时结合于催化位点，形成酶–MgADP–Pi复合物，使酶维持在活性中间态，从而避免形成MgADP抑制态。Pi的存在使催化循环中的平衡从MgADP抑制态向酶–MgADP–Pi活性复合物方向移动。由于Pi的最大保护程度仅为69%，提示还存在其他无活性的酶–MgADP–Pi复合物，即使有过量Pi存在，平衡也不能完全移至活性复合物一侧。在膜结合ATP合酶中，膜能量化可能将无活性形式转化为活性形式，Pi与膜能量化的联合作用可能使酶在磷酸化条件下完全免受ADP抑制。该研究还指出，Pi对ATP结合干扰的表观Kd（19 mM）和Pi阻止MgADP抑制态形成的表观Kd（21 mM）高于嗜热F₀F₁-ATP合酶在蛋白脂质体中ATP合成的表观Km（6–9 mM），这种差异可能源于实验条件不同或膜电位的影响。此外，Pi对ATP结合的干扰主要在双位点结合条件下明显，提示第一个催化位点倾向于结合ATP，而第二个催化位点倾向于结合Pi，这支持了Boyer提出的催化位点在不同构象中对底物和产物具有不同选择性的观点。

该研究的亮点在于利用基因工程手段在催化位点附近引入色氨酸荧光探针，结合不能水解ATP的突变体，分别实时监测了Pi存在下MgADP和MgATP与催化位点的结合过程，从而直接证明了Pi并不阻止MgADP的结合，而是通过形成酶–MgADP–Pi活性中间复合物来抑制MgADP抑制态的产生。这一发现加深了对F1-ATPase催化循环中Pi作用的理解，为阐明F₀F₁-ATP合酶在ATP合成方向上的催化机制提供了重要线索。